全球抗菌药物耐药性（AMR）对公共卫生构成了日益严重的威胁[1]，[2]，[3]，[4]，其耐药机制的发展速度超过了新药物的研发速度[5]。优化现有疗法对于限制多重耐药（MDR）病原体的传播至关重要[6]，[7]。这需要精确选择、剂量控制和抗生素的使用时间，因此抗菌药物敏感性测试（AST）对于指导针对性治疗和防止广谱抗生素的滥用至关重要[8]，[9]。因此，开发快速可靠的AST方法对于改善临床结果、减缓AMR的进展和支持有效的抗菌药物管理至关重要。
传统的AST方法，如纸片扩散法、E-test和肉汤稀释法（BMD），被视为临床金标准[10]，[11]。这些方法通过测量多样且异质的细菌群体的整体行为来确定最小抑制浓度（MIC），即防止可见生长的最低抗菌药物浓度[12]。MIC值是分析表型耐药性的关键参数，有助于评估新抗生素的有效性，并为治疗指南提供依据[13]。然而，这些基于群体的方法需要较长的培养时间，通常从样本采集到最终结果需要数小时甚至数天。这种漫长的时间线是一个主要缺点，因为需要分离和培养细菌，然后通过多次细胞分裂周期后观察浑浊度或测量吸光度。在此关键期间，临床医生常常凭经验开具广谱抗生素，以防止患者病情恶化[14]，无意中促进了更广泛的AMR的出现。
除了速度问题外，传统方法还存在测量不准确的问题。它们容易产生假阳性结果，因为它们假设细菌培养的浑浊度与其细胞数量之间存在线性关系，但这一前提往往不成立，因为某些抗生素可以改变细菌的形态和大小[15]，[16]，[17]。此外，它们无法考虑细菌群体内的固有异质性，可能导致假阴性结果[18]。通过测量整个群体的行为，它们可能无法检测到罕见的耐药亚群，从而提供有限的早期表型反应信息。这可能导致药物效力的错误分类，导致使用无效药物或排除潜在有用的药物。因此，最近的AST进展集中在通过监测较小细菌亚群的增殖来减少检测时间，从而使临床医生能够更快、更明智地做出治疗决策。
基于微流控的AST方法因其能够在受控微环境中进行高通量检测而成为强大的替代方案[19]，[20]。液滴微流控技术能够将单个细菌细胞隔离在液滴中，从而在几小时内识别出具有耐药表型的罕见细菌及其异质性[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]，[27]。单个细菌的隔离允许高度敏感地监测表型的细微变化，包括代谢、基因组成、形态或复制的改变。利用这种方法，多项研究表明可以在不到12小时内获得MIC值，显著快于传统的表型AST方法。
此外，基于光学成像的方法通过监测细菌增殖和在不同抗生素条件下的单细胞生长动态来加速AST[24]，[28]。然而，这些技术通常依赖于将细菌固定在结构化环境中，如琼脂糖凝胶基质、介电泳陷阱、受限微通道和纳升级孔[29]，[30]，[31]，[32]。它们通常需要复杂的高分辨率光学设置和多个视野的连续监测，从而增加了系统的复杂性和成本，并限制了其临床应用性。另一种方法是通过悬臂式质量测量、异步磁珠旋转和增强氧气输送的方法来检测微妙的物理或代谢变化[33]，[34]，[35]，[36]。尽管如此，这些方法往往涉及复杂的读数，并且尚未在多个抗生素浓度下实现可扩展或多路复用。
单细胞水平分析也越来越受到关注，因为它能够解析表型异质性并揭示在群体平均结果中常被掩盖的具有不同抗生素反应的亚群[26]，[37]，[38]，[39]。尽管已经展示了多种不同的方法，包括基于光学、荧光和阻抗的细胞反应检测方法，但仍存在一个关键缺口，因为它们仍然依赖于细胞增殖，这延迟了最终的分类。这突显了需要一种新的方法，能够捕捉到对抗生素压力的快速细胞反应，例如代谢活动，而不仅仅依赖于可见生长。
已知杀菌性抗生素会通过干扰细胞稳态和代谢途径来触发活性氧（ROS）的产生[40]，[41]。量化ROS可以检测到细胞数量可测量变化之前的早期氧化应激反应，提供了更快且可能更具信息量的抗生素效力指标[42]，[43]，[44]，[45]。与基于浑浊度的生长测量、阻抗传感或依赖群体扩张的代谢染料等替代AST方法相比，ROS敏感荧光能够在几十分钟内检测到抗生素诱导的细胞应激。由于ROS生成代表了细胞分裂之前的早期代谢反应，因此可以在不需要等待可测量生物量增加的情况下评估敏感性，这是传统基于生长的检测方法中的根本时间限制步骤。然而，由于在单细胞水平上将ROS动态与表型敏感性相关联的技术挑战，基于ROS的AST尚未得到广泛应用。此外，难以将ROS水平与细胞密度等混淆因素分离，也阻碍了建立稳健的分类阈值。
在这项研究中，我们提出了一种基于ROS的微流控平台，该平台将浓度梯度的形成与随后将单个细菌、抗生素和ROS敏感染料封装在液滴中结合起来，以实现快速AST。我们的方法同时量化了单细胞水平上的ROS信号和细菌细胞数量，允许将每个细胞的ROS变化倍数标准化作为敏感性指标。这种方法不仅将检测时间缩短至90分钟内，还揭示了批量测量中隐藏的表型异质性。
我们使用20种不同的临床分离株验证了该平台的稳健性和临床相关性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、多重耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）以及耐多粘菌素和大肠杆菌。我们的结果直接与使用金标准BMD方法获得的结果进行了比较。重要的是，基于ROS的AST使我们能够识别出表现出部分耐药性或耐受性的亚群。该平台不仅提供了快速准确的AST，还提供了关于抗生素作用和耐药机制的基本见解，在时间效率和分析分辨率方面相比传统的依赖生长的方法具有显著优势。能够在临床重要病原体上进行快速AST测试，有潜力加快临床结果的速度，最终有助于更快地为患者开具适当的抗生素。
