《Veterinary Microbiology》：Genome-Wide Comparison Analysis of
Brucella Attenuated Vaccine Strain BA0711 and
Brucella Wild-Type Strain M28 and Establishment of a Dual qPCR Differentiation Method
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布鲁氏菌疫苗株BA0711的基因组比较及qPCR检测方法开发。通过全基因组测序和功能分析，发现BA0711与野生株M28相比在染色体I和II存在199和144个基因变异，导致能量代谢、应激防御等关键功能减弱，但保留宿主适应性和免疫原性。建立的双TaqMan qPCR方法可灵敏检测（1×101拷贝/μL）并区分疫苗株、野生株及混合感染，为布鲁氏病防控提供精准诊断工具。
谢明明|孙一鸣|高娃|刘晓芳|卢静|王文龙|刘春霞
内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊断与治疗技术重点实验室，中国内蒙古自治区呼和浩特市，010010
摘要
布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌属（Brucella）引起的动物源性疾病，对畜牧业生产和公共卫生构成严重威胁。疫苗免疫仍然是预防和控制该疾病的关键策略。本研究旨在阐明布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711的毒力减弱机制的遗传基础。我们完成了布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711的全基因组测序和功能注释，并与野生型布鲁氏菌株M28进行了系统的基因组比较。结果表明，与野生型布鲁氏菌株M28相比，布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711 I和II在1号和2号染色体上分别具有199个和144个突变、缺失以及独特的基因片段。尽管布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711保持了较强的宿主适应性和活力以及免疫原性，但其基因组缺乏编码冷休克蛋白和谷氨酰胺转移酶的基因。功能注释显示，与野生型布鲁氏菌株M28相比，其在能量代谢、应激防御、耐药性、毒力表达和基因组可塑性方面存在缺陷。基于全基因组测序数据，我们开发了一种差异化的TaqMan qPCR检测方法。该方法通过针对布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711的特定基因片段，表现出高灵敏度（1×101拷贝/μL）、优异的特异性以及高稳定性（批内和批间变异系数低于0.5%）。对100个样本的检测证明了该方法能够准确区分布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711、其他布鲁氏菌血清型以及混合感染。本研究为流行病学监测、预防策略制定以及临床诊断和治疗提供了可靠的参考，有助于减轻布鲁氏菌病对公共卫生和畜牧业的潜在威胁。
引言
布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌属（Brucella）引起的动物源性疾病（De Figueiredo等人，2015年）。该疾病在全球范围内广泛传播，影响了170多个国家和地区（Fusco等人，2024年，Fusco等人，2024b年），可能导致重大经济损失，对全球畜牧业和公共卫生构成严重威胁。世界动物卫生组织将其列为B类动物疾病，中国将其列为II类动物疾病。经典的布鲁氏菌属包括六个血清型（Al Dahouk等人，2017年），如布鲁氏菌梅利滕西斯（Brucella melitensis）、布鲁氏菌流产（Brucella abortus）和布鲁氏菌猪（Brucella suis）。其中，布鲁氏菌梅利滕西斯对人类的威胁最大，其次是布鲁氏菌猪，而布鲁氏菌流产的毒力相对较弱（Xiong等人，2021年）。巨噬细胞、树突状细胞和滋养层细胞是布鲁氏菌感染初期的主要靶标（Deng等人，2019年）。细菌进入宿主细胞后，会被宿主膜包裹形成含有布鲁氏菌的液泡（BCV）（Archambaud等人，2010年；Celli，2015年；Kohler等人，2002年）。BCV首先获得早期内体特征（eBCV），然后转变为具有相应分子标记的晚期内体（Guimar?es等人，2025a年；Guimar?es等人，2025b年）。同时，液泡与溶酶体的融合会导致液泡酸化并杀死大多数细菌，这一过程对于IV型分泌系统（T4SS）的VirB成分的表达至关重要，而VirB是布鲁氏菌的关键毒力因子（Roux等人，2007年；Starr等人，2008年）。经过这种受控融合后，BCV依次分化为复制型BCV（rBCV）（Guimar?es等人，2025a年；Guimar?es等人，2025b年），并进一步成熟为自噬型BCV（aBCV）（Starr等人，2012年）。除了T4SS之外，其他毒力决定因子如脂多糖（LPS）（Barquero-Calvo等人，2007年；Masjedian Jezi等人，2019年）和BvrR/BvrS双组分系统（G?owacka等人，2018年；Coloma-Rivero等人，2022年）也共同促进了细菌对宿主细胞表面的识别和附着，从而建立了有利于细菌生存的细胞内环境。
深入研究布鲁氏菌的致病机制是建立布鲁氏菌病预防和控制体系的关键组成部分，而开发精确、简单且高度特异的诊断方法是预防和控制工作的另一个关键要素。分子生物学检测技术具有操作简便、高准确性和强适应性的特点。实时定量聚合酶链反应（qPCR）是分子生物学检测技术中的关键方法（Shahrajabian，Sun，2024年）。通过使用荧光标记探针或双链结合染料，它可以实时监测核酸扩增过程，并实现对目标序列的精确定量（Quan等人，2018年）。这显著提高了检测灵敏度和特异性，同时基于基因组变异位点促进了不同物种之间的鉴别诊断。目前，中国控制布鲁氏菌病的方法结合了疫苗接种、检疫和消灭措施。常用的疫苗包括布鲁氏菌减毒疫苗株S2、布鲁氏菌减毒疫苗株A19、布鲁氏菌减毒疫苗株Rev.1（Hou等人，2019年）和布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711。然而，一些接种疫苗的动物可能会出现类似自然感染的症状，表明布鲁氏菌疫苗可能会干扰疾病诊断。传统的检测方法无法区分布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711感染与其他布鲁氏菌血清型的感染。因此，开发一种能够区分布鲁氏菌疫苗株BA0711感染与其他布鲁氏菌血清型感染的检测方法至关重要。本研究通过全基因组测序和比较功能分析，阐明了布鲁氏菌疫苗株BA0711的基因组功能和毒力减弱机制的遗传基础。此外，基于该疫苗株中的特定基因缺失片段，建立了一种能够准确区分布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711、野生型布鲁氏菌株及其混合感染的qPCR检测方法。这种方法旨在为布鲁氏菌病的精确诊断提供参考。
样本来源
样本来源
布鲁氏菌减毒疫苗株（BA0711、Rev.1、A19、S2和M5-90Δ26）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巴氏杆菌（Pasteurella）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）和假结核分枝杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）的基因组DNA样本保存在中国内蒙古农业大学预防兽医学实验室。
从内蒙古自治区呼和浩特市的一个羊场收集了100个样本（包括抗凝和非抗凝样本）
布鲁氏菌减毒疫苗BA0711的全基因组测序结果和功能基因分析
布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711的全基因组长度为3,310,438 bp（约3.31 Mb）。1号染色体长度为2,125,891 bp，2号染色体长度为1,184,547 bp（图1）。测序深度为656×，总GC含量为57.22%。编码区总长度为2,881,897 bp，包含3,148个蛋白质编码基因，平均基因长度为896 bp。基因组中含有55个tRNA基因、9个rRNA基因（5S、16S和23S各3个）以及1个tmRNA基因，没有sRNA基因。
讨论
与野生型布鲁氏菌株M28相比，布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711在1号染色体上缺乏一个冷休克蛋白基因片段。CspA家族在大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中已被充分研究（Ermolenko和Makhatadze，2002年；Phadtare和Inouye，2004年；Phadtare，2004年），并已被证明在布鲁氏菌的代谢调节和毒力中起关键作用（Wang等人，2015年）。这种蛋白质的缺失降低了疫苗株应对压力的能力。
结论
从功能遗传学角度来看，布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711保留了关键的免疫原性、跨物种保护潜力以及多重耐药机制，同时通过精确调控毒力相关基因实现了毒力减弱。与野生型株M28相比，其致病性显著降低，是一种高效且安全的布鲁氏菌病控制候选疫苗。
本研究成功建立了一种特定的检测方法
未引用的参考文献
（Wang等人，2016年；Wang等人，2014年；Kim等人，2016年）
资助
本研究得到了以下资助：内蒙古自然科学基金（项目编号2025LHMS03024）、内蒙古自然科学基金（项目编号2025MS03010）、内蒙古一流学科研究专项（奖项编号YLXKZX-NND-012）
作者贡献声明
谢明明和孙一鸣负责起草手稿，对布鲁氏菌减毒疫苗株BA0711和毒力株M28进行了组学分析，并开发了差异化的双TaqMan qPCR检测方法。样本收集和检测工作由高娃、卢静和刘晓芳完成。研究设计由王文龙教授和刘春霞教授负责，他们还领导了基因组数据分析工作。
作者贡献声明
谢明明：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究设计。
高娃：验证、监督、概念构建。
孙一鸣：写作——初稿撰写、可视化、监督、概念构建。
刘春霞：写作——审稿与编辑、验证、监督、方法学、数据管理、概念构建。
王文龙：写作——审稿与编辑、验证、监督、资源协调、方法学。
卢静：可视化、验证。
致谢
感谢王文龙教授和刘春霞教授在本研究中的关键指导和支持。同时，我们也感谢内蒙古呼和浩特市的一个羊场提供了临床血液样本。此外，我们感谢本研究中使用的公共数据库提供的宝贵资源。
利益冲突声明
本文的所有作者声明他们与可能不恰当地影响研究结果的其他个人或组织没有财务或个人关系。
