《Virology》：Exploring the possible cause of different levels of RNA silencing against BNYVV in transgenic sugar beets: a comparative virus transcriptome study
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RNA干扰诱导的抗甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）转基因甜菜存在田间抗性差异，通过RNA-seq和小RNA-seq分析发现，共侵染的甜菜土壤传带病毒（BSBV）和甜菜卫星病毒（BSV）导致RNA沉默系统减弱，从而影响BNYVV抑制效果。
穆罕默德·阿明·巴格里（Mohammad Amin Baghery）| 马赫迪耶·优塞菲阿拉（Mahdieh Yousefiara）| 穆罕默德·阿里·马尔布比（Mohammad Ali Malboobi）| 玛丽亚姆·科什纳米（Maryam Khoshnami）| 法伊兹·法拉基（Faezeh Falaki）| 阿卜杜勒雷扎·巴赫里（Abdolreza Bagheri）| 纳斯林·莫斯塔吉（Nasrin Moshtaghi）
伊朗德黑兰国家遗传工程与生物技术研究所农业生物技术研究所
摘要 甜菜因其高蔗糖含量而成为最重要的经济作物之一。然而，全球甜菜生产受到甜菜坏死黄脉病毒 （BNYVV）的严重威胁。开发抗性转基因品种是控制这种疾病的一种有前景的方法。我们的团队通过引入携带BNYVV正义链和反义链5’-UTR序列的构建体（分别包含或不包含外壳蛋白（CP21）编码序列），成功地在两个转基因品系S3和S6中产生了对BNYVV的RNA沉默诱导抗性。然而，在某些转基因植物后代中，基于RNA沉默的抗性可能会减弱或失效。本研究利用高通量病毒转录组分析来探讨具有相同遗传背景的转基因甜菜之间BNYVV传播水平差异的可能原因。RNA-seq和small RNA-seq结果显示不同样本间的病毒传播水平存在差异。定量RT-PCR和茎环PCR表明RNA沉默机制能够有效地将转基因转录本转化为siRNAs。随后证实所有具有感染性的BNYVV都属于A型生态型，其与S3和S6转基因的序列同源性分别为96.3%和98.3%。有趣的是，在高度感染的样本中检测到了甜菜土传病毒 （BSBV）、甜菜隐秘病毒2 （BCV2）和甜菜卫星病毒 （BSV）。详细分析表明，转基因植物中BSBV和BSV的同时存在可能与BNYVV的RNA沉默作用减弱有关。
引言 甜菜是一种非常重要的工业作物，因为它含有高浓度的蔗糖，可满足全球约30%的糖需求（Dohm等人，2014年）。多种传染性病毒对甜菜的产量和质量具有毁灭性影响。其中之一就是甜菜坏死黄脉病毒 （BNYVV），它是导致根肿病的病原体，可使甜菜产量损失高达80%（Biancardi和Lewellen，2016年）。BNYVV由Polymyxa betae 传播，这是一种土壤传播的原生动物，它是许多植物（包括甜菜）的专性根部寄生虫，可以通过产生休眠孢子在土壤中长期存活（Biancardi和Lewellen，2016年；Pferdmenges，2007年）。这使得在田间控制这种疾病极具挑战性。迄今为止，控制根肿病的唯一有效方法是使用携带< />和< />抗性基因的品种（De Biaggi等人，2010年）。然而，通过传统育种方法开发的品种对抗新株系的BNYVV的抗性经常会被破坏（Kutluk Yilmaz等人，2018年；Liebe等人，2023年；Nakagami等人，2022年）。
通过基因工程引入新的抗性来源可能是解决这一问题的方法（Dhir等人，2019年；Palukaitis，2011年）。在过去十年中，已经开发了几种基于病原体诱导抗性（PDR）的策略来培育抗性植物（Palukaitis，2011年；Uslu和Wassenegger，2020年）。利用RNA沉默作为植物的天然防御机制来诱导抗病毒抗性是一种众所周知的方法（Lu等人，2003年；Uslu和Wassenegger，2020年）。这种方法涉及将特定的病毒序列整合到植物基因组中，从而通过产生短干扰RNA（siRNAs）来触发针对目标病毒的RNA沉默（Duan等人，2012年；Lu等人，2003年）。尽管如此，转基因介导的抗性可能受到多种因素的影响，导致抗性水平不一，从完全恢复到弱抗性不等（Duan等人，2012年；Prins等人，2008年）。植物中这种现象的机制尚不完全清楚。据认为，高效抗性的第一步是转基因的高表达，这会触发RNA沉默机制。否则，转基因衍生的siRNAs积累不足会导致抗性延迟或无效（Duan等人，2012年；Prins等人，2008年）。病毒的致病类型也会影响宿主的抗性和感染程度（Liebe等人，2023年）。多项研究表明，某些类型的BNYVV可能导致甜菜抗性减弱（Liebe等人，2023年；Nakagami等人，2022年；Peltier等人，2008年）。此外，病毒衍生的转基因与目标病毒之间的序列同源性也是一个重要因素。当感染病毒的序列与转基因序列相差超过10%时，抗性机制可能会减弱（Duan等人，2012年）。此外，植物在田间可能同时暴露于多种异源病毒（Moreno和López-Moya，2020年）。特别是，已经发现一种异源病毒可能通过RNA沉默抑制机制增强另一种病毒的感染（Anand等人，2022年；Aulia等人，2019年）。其中，多种甜菜病毒由Polymyxa betae 传播，包括甜菜土传病毒 （BSBV）、甜菜土传花叶病毒 （BSBMV）、甜菜橡叶病毒 （BOLV）和甜菜病毒Q （BVQ），这些病毒可能与BNYVV有协同或拮抗作用（Bornemann和Varrelmann，2011年）。
准确检测和鉴定感染转基因植物的病毒组成及其遗传特征有助于理解沉默水平差异的原因（Jeevalatha等人，2023年；Ko等人，2018年；Li等人，2016年）。下一代测序（NGS）技术的发展以及数据处理平台的巨大进步为快速、准确、经济高效的大规模病毒群体测序奠定了基础（Lecuit和Eloit，2015年；Villamor等人，2019年；Weiland等人，2020年）。大多数植物病毒具有RNA基因组，即使那些具有DNA基因组的病毒也会表达RNA转录本。在这种情况下，RNA-Seq技术是一个强大而有效的工具，因为它可以提供样本中所有RNA病毒的概览（Jones等人，2017年；Weiland等人，2020年）。此外，小RNA测序（sRNA-Seq）最近也成为一种流行的工具，可以提供关于植物中病毒衍生siRNAs的宝贵信息（Guo等人，2015年；Li等人，2016年；Sun等人，2020年）。
我们的团队成功培育出了对根肿病具有RNA沉默诱导抗性的转基因植物，通过诱导针对BNYVV外壳蛋白的基因沉默（Safar等人，2021年；Zare等人，2015年）。然而，在某些后代中观察到不同程度的病毒传播，尤其是在田间评估中。因此，尽管基因相同，植物对病毒传播的抑制程度却有所不同。为了解决这个问题，本研究旨在使用NGS方法（RNA-Seq和sRNA-Seq）对受BNYVV感染的转基因植物根部的病毒RNA谱进行比较分析。
部分内容 植物和生长条件 使用了先前开发的转基因甜菜品系219-T3: S3-13.2（S3）和6018-T3: S6-44（S6），这些品系携带带有或不带有BNYVV外壳蛋白（CP21）编码序列的正义链和反义链5’UTR序列，并置于35S-CaMV启动子下（补充图S1）（Zare等人，2015年）。本研究中使用的对照野生型亲本植物为9597（WT），由伊朗卡拉杰的甜菜种子研究所提供。每株植物的种子被播种在光照周期为16/8小时的植物生长箱中RNA-seq分析 对第三代转基因甜菜品系S3和S6的根部分别携带pIHP-P和pIHP-U构建体的根样本进行了RNA测序（Zare等人，2015年），同时对其野生型亲本9597也进行了测序，每个样本进行了两次生物学重复实验。总共生成了约20 GB的数据，包含大约1.36亿个读段（每个读段150 bp），所有库的序列质量至少达到97%（质量分数超过Q20；表1）。讨论 尽管RNA沉默介导的抗性已被证明可以有效保护植物免受病毒侵害，但由于其在不同条件下的抗性水平变化，这种方法仍存在一些问题。本研究旨在通过比较转录组分析来探讨转基因植物中BNYVV感染程度差异的原因。几乎所有转基因品系都表现出足够的抗性
结论 本研究旨在探讨RNA沉默诱导的转基因甜菜中BNYVV抗性水平差异的可能原因。经过分析多种可能的原因，我们发现那些BNYVV积累量较高的转基因植物同时感染了BSBV和BSV。所呈现的数据表明BSV、BSBV和BNYVV RNA的积累之间存在关联，并且这导致了转基因植物中RNA沉默系统的减弱（图6）。
CRediT作者贡献声明 阿卜杜勒雷扎·巴赫里（Abdolreza Bagheri）： 撰写 – 审稿与编辑，监督，概念设计。法伊兹·法拉基（Faezeh Falaki）： 验证，资源提供。纳斯林·莫斯塔吉（Nasrin Moshtaghi）： 撰写 – 审稿与编辑，监督，概念设计。穆罕默德·阿明·巴格里（Mohammad Amin Baghery）： 撰写 – 初稿撰写，可视化，验证，软件使用，方法学研究，数据分析，数据整理。马赫迪耶·优塞菲阿拉（Mahdieh Yousefiara）： 撰写 – 审稿与编辑，资源提供，方法学研究，调查，概念设计。玛丽亚姆·科什纳米（Maryam Khoshnami）： 资源提供。穆罕默德·阿里·马尔布比（Mohammad Ali Malboobi）： 数据可用性 原始读段已存入Sequence Read Archive（SRA）数据库，生物项目编号为PRJNA1394332 资助 本研究部分得到了伊朗国家遗传工程与生物技术研究所（项目编号167和102M）和绿色转基因技术发展公司（德黑兰，伊朗）的资助。利益冲突声明 ? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢 我们感谢伊朗国家遗传工程与生物技术研究所的支持。
