《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Development of a high ethyl hexanoate-producing strain via ARTP mutagenesis and fermentation optimization using agricultural by-products
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乙基己酸酯高产菌株阿辛托体贝雷辛氏菌B-6经ARTP诱变后得突变株4-8，产量提升129.38%达52.00 mg·L?1。通过优化培养基配方，利用淀粉、 peptone和NaCl的低成本配方使产量增至67.00 mg·L?1，进一步结合农业副产品（如秸秆水解液和糖蜜）进行发酵条件优化，最终实现96.00 mg·L?1的高效生产。该研究建立微生物定向改良与农业废弃物资源化联用的高值酯类生物制造体系。
李玉玲|王志强|万仁志|曾欣|辛冰月|张彪|乔杰|赵德印|赵明涛|谢友玉|姜庄庄|曾华为|张亮
安徽省污染物敏感材料与环境修复重点实验室/淮北师范学院生命科学学院农产品生物加工重点实验室，中国淮北235000
摘要：
在本研究中，从浓香型大曲中分离出一种能够产生己酸乙酯的菌株。通过16S rDNA测序进行分子鉴定，确认其为Acinetobacter bereziniae B-6。经过大气和室温等离子体（ARTP）诱变处理后，获得了一株名为4-8的突变体，其己酸乙酯产率为52.00 ± 2.00 mg·L-1，比亲本菌株提高了129.38%。营养需求分析表明，去除酵母提取物并补充5 g·L-1可溶性淀粉后，产率提高到67.00 ± 2.00 mg·L-1。随后，配制了一种主要由淀粉、蛋白胨和NaCl组成的低成本培养基，使产率进一步提高至72.00 ± 3.00 mg·L-1-1，提高了33.3%。当添加0.6%小麦秸秆水解物并在pH 7.0、40°C下发酵48小时后，产率增加到95.00 ± 2.00 mg·L-1，提高了31.9%。本研究提供了一种高产己酸乙酯的微生物菌株以及一种利用农业副产品进行风味酯生物合成的低成本发酵策略。
引言
己酸乙酯是浓香型白酒中的关键香气化合物，其含量直接决定了白酒的香气特征和质量等级（Hong, J.等人，2023；Xu, Y.等人，2022）。作为占据白酒市场约70%的主导香气类型，提高己酸乙酯的合成效率具有重要的工业意义。在传统的固态发酵过程中，己酸乙酯主要通过己酸和乙醇的酯酶催化反应生成（Liu, G.等人，2023）。然而，当前的生产系统普遍面临己酸乙酯含量较低的技术挑战。与能耗高且选择性较低的化学合成方法（Zhang, C.等人，2023）以及产物复杂、周期较长的全细胞发酵方法（Guan, T.等人，2023）相比，酶催化方法由于其反应条件温和、催化特异性高、副产物少且符合绿色制造原则（Wu, Z.等人，2021），被认为是一种更有前景的工业途径。因此，通过育种或工程手段开发高产己酸乙酯的优良微生物菌株，对于提高这种风味酯的生物合成效率至关重要。
然而，酶催化途径的工业化面临两个主要挑战：首先是天然酯酶产生菌株的性能有限，导致催化能力不足（Xu, C.等人，2020）；其次是传统发酵培养基依赖于酵母提取物和蛋白胨等昂贵成分，导致生产成本较高（Karray, F.等人，2021）。为了解决这些问题，本研究提出了一种综合策略，旨在同时改进目标菌株和发酵原料，以建立高效、经济且可持续的酯酶介导的己酸乙酯生产系统。
在微生物育种中，大气和室温等离子体（ARTP）诱变技术因其高突变率和操作安全性等优点而被广泛用于工业微生物的改良（Khan, S. A.等人，2015；Liu, K.等人，2020）。在发酵原料方面，利用秸秆等农业副产品作为培养基成分有助于资源循环和过程可持续性（Georganas, A.等人，2023；Guo, T.等人，2015）。现有研究表明，小麦秸秆水解物和糖蜜可以作为多种微生物发酵过程中的替代碳源（Alvarez-Guzmán, C. L.等人，2020）。例如，Salamony等人利用重组Bacillus subtilis开发了一种固态发酵系统，实现了80%的鸡羽毛降解，并产生了高活性的蛋白酶和可溶性蛋白质（El Salamony, D. H.等人，2024）。尽管这些研究并未直接针对酯酶介导的己酸乙酯合成，但它们在原料利用和过程优化方面的方法为基于农业废弃物的高效酯酶催化发酵过程提供了宝贵见解。
尽管先前的研究尝试通过菌株筛选（例如Staphylococcus epidermidis）（Xu, P.等人，2023）和代谢工程（例如酵母菌株α5-FAS1ΔOPI1）（Chen, Y.等人，2016）来提高己酸乙酯的产率，但现有系统的生产水平仍无法满足工业需求。此外，结合高效诱变育种和农业废弃物资源利用的综合研究相对缺乏。因此，本研究设计了一种多阶段策略，包括从传统发酵起始菌中筛选野生菌株、ARTP诱导的诱变、开发基于农业副产品的低成本培养基以及系统优化发酵条件，以建立高效的酯酶介导的己酸乙酯生产系统。这种方法不仅有助于获得高产己酸乙酯的菌株并实现白酒风味的定向调节，还为农业副产品的价值化和绿色可持续生物制造提供了综合解决方案。
材料
实验中使用的所有有机酸，包括无水乙醇、丁酸、己酸、乳酸和醋酸，均为分析级，购自中国上海的中药化学试剂有限公司。小麦秸秆粉从淮北师范学院附近的当地农贸市场获取，糖蜜由当地糖厂提供。
原料预处理
小麦秸秆水解物的制备方法参考了（Liu, G.等人）的报告。
筛选高酯化能力的菌株
从大曲样本中初步分离出50个具有明显菌落的细菌菌株，表明其具有酯酶或脂肪酶活性。根据菌落直径与晕圈直径的比例（D/d），选出了18个具有较高三丁酸酯水解活性的菌株进行进一步评估（表1）。其中，A-4、C-8和D-7菌株的D/d值最高（均≥1.70），表明其酯化能力较强。
为了评估它们的实际酯化能力，选择了10个菌株
讨论
本研究成功分离并鉴定出一种具有高酯化能力的Acinetobacter bereziniae菌株。该属菌株在生物修复（例如石油烃、酚类和重金属的降解）和生物合成领域引起了广泛关注，特别是它们能够产生工业酶（如脂肪酶）和高价值化合物（Nimkande, V. D.等人，2023）。例如，Ahmed等人使用脂肪酶EH28
结论
本研究从大曲中分离出一种高产己酸乙酯（22.67 ± 1.53 mg·L-1）的菌株，并通过16S rDNA分析鉴定为Acinetobacter bereziniae B-6。ARTP诱变得到了一个更优的突变体4-8，其己酸乙酯产率为52.00 ± 2.00 mg·L-1，比亲本菌株提高了约129%。后续的发酵优化采用了基于淀粉和蛋白胨的低成本基础培养基，使产率进一步提高。
CRediT作者贡献声明
曾华为：项目管理、方法论、资金获取、概念构思。李玉玲：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法论、调查、数据分析、概念构思。姜庄庄：数据可视化、数据管理。万仁志：验证、调查、数据分析。张亮：写作 – 审稿与编辑、验证、监督、资源提供。王志强：写作 – 审稿与编辑、数据分析
未引用的参考文献
Costa等人，2021；Wang等人，2024；Zhang等人，2023。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
资助
本研究得到了安徽省教育厅的重点自然科学研究项目（项目编号：2024AH051691和2024AH051699）以及国家大学学生创新与创业项目（项目编号：202410373010）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
