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肥胖与暴食行为及奖赏通路异常激活相关，下丘脑神经肽orexin-A和μ-阿片受体信号在摄食行为及奖赏处理中起重要作用。本研究通过荧光金逆行追踪、免疫组化染色和药物干预，揭示PeF与VTA间的神经投射，证实VTA多巴胺神经元通过OX1-R和μ-阿片受体信号通路调控高脂高糖食物寻求行为，并发现orexin-A与NTX的协同抑制作用。
栾晓|刘洋|张晓倩|孙向荣|郭菲菲|王咪
青岛大学生物医学中心，中国山东省青岛市，266000
摘要
目的
肥胖与暴饮暴食和奖赏通路的异常激活有关。下丘脑神经肽（如食欲素-A）和μ-阿片受体信号传导在进食行为和奖赏处理中起着重要作用；然而，食欲素-A与μ-阿片受体信号传导在寻求美味食物中的作用机制尚不清楚。
材料与方法
我们使用荧光金逆向追踪技术研究了围食区（PeF）与腹侧被盖区（VTA）之间的神经投射。通过免疫组化染色评估了VTA中食欲素-A受体1（OX1-R）和酪氨酸羟化酶（TH）神经元的分布。随后，向VTA给药以研究食欲素-A与μ-阿片受体拮抗剂纳曲酮（NTX）在调节寻求美味食物行为及VTA多巴胺（DA）神经元放电频率方面的相互作用。
主要发现
在PeF中观察到荧光金标记的食欲素-A神经元，并在VTA中检测到OX1R和TH神经元的共定位。此外，对PeF进行电刺激或向VTA注射食欲素-A可增加TH阳性神经元中c-Fos的表达，为这项研究提供了解剖学基础。向VTA微注射食欲素-A可促进大鼠寻求美味食物的行为，这一效应可被预先注射的OX1R拮抗剂SB-334867完全阻断。此外，食欲素-A和NTX被发现可以调节VTA DA神经元的放电频率，表明它们可能通过影响VTA DA神经元来调节寻求美味食物的行为。
意义
本研究揭示了食欲素-A与μ-阿片系统在调节寻求美味食物行为及VTA DA神经元放电频率方面的相互作用。
引言
肥胖及其相关并发症会对人类健康造成巨大危害，近年来肥胖的发病率急剧上升，并逐渐成为全球性问题[1]。肥胖是一种综合性疾病，主要由过量进食引起，而进食行为受到大脑中枢神经系统中的奖赏和成瘾系统的调控[2]。食物奖赏回路系统会促使啮齿动物在能量需求得到满足后仍继续进食[3]。食欲素系统（包括两种神经肽食欲素-A和食欲素-B）与进食行为和奖赏通路密切相关[4,5]；食欲素-A神经元分布于下丘脑的多个区域，包括外侧下丘脑、外侧背侧下丘脑和围食区（PeF）[6],[7],[8]。先前的研究表明，向大鼠脑室内注射食欲素-A可增加其食物摄入量[9]，而向第三脑室微注射食欲素-A可选择性增加其对高脂肪食物的摄入，这表明食欲素-A可能与大鼠的食物偏好有关[10]。美味的高脂肪和高糖食物可能导致大鼠表现出非稳态的、由奖赏驱动的进食行为，这可能是肥胖的原因之一[11]。鉴于食欲素系统的潜在抗肥胖作用，它受到了广泛关注。
研究表明，阿片肽受体在大脑中广泛分布，如纹状体和丘脑的苍白球、尾状核等区域，μ-阿片肽受体信号与肥胖和暴饮暴食行为密切相关[12,13]。长期腹腔注射纳曲酮（NTX）可抑制大鼠的食欲并减少能量产生[14]，而向外侧下丘脑微注射NTX可急性抑制其进食行为[15]。这表明NTX在外周或中枢神经系统中的注射可能调节大鼠的进食行为。长期摄入美味食物会导致中脑边缘区域μ-阿片受体表达和功能的变化，这也表明μ-阿片受体信号通路与奖赏或成瘾系统有关[16]。此外，内源性阿片类物质在食欲素系统中起着关键作用，食欲素已被证明可通过抑制强啡肽信号来促进奖赏寻求行为[17]。这些研究表明食欲素和阿片类物质之间可能存在相互作用。然而，尚不清楚μ-阿片受体是否参与调节大鼠对美味食物的摄入。
腹侧被盖区（VTA）是奖赏系统的重要组成部分，该区域含有丰富的多巴胺能神经元[18]。已知食物可在不涉及味觉受体的情况下激活多巴胺通路，大鼠可能因进食对情绪的影响而对美味食物表现出偏好[19]。食欲素-A可促进大鼠的食物摄入并激活其多巴胺（DA）神经元[20,21]。然而，食欲素-A与μ-阿片受体信号在调节VTA DA神经元放电频率及寻求美味食物行为方面的相互作用尚不清楚。因此，我们的研究旨在确定食欲素-A信号是否通过影响VTA DA神经元的放电频率来调节寻求美味食物的行为，以及μ-阿片受体信号是否参与这一信号通路。
实验部分
动物
本实验共使用了162只健康的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（体重280-340克，年龄8至10周），这些大鼠购自中国山东省青岛市药物控制研究所。另外购买了20只双食欲素受体基因敲除（DOR?/?）的C57BL/6雄性小鼠（体重22-28克，年龄12至22周），来自中国广东省Cyagen公司，同时使用了20只野生型对照组小鼠作为对照。选择大鼠进行实验是因为它们在食物摄入量方面的个体差异较小。
食欲素-A在VTA中的给药对大鼠寻求美味食物行为的影响
36只大鼠被随机分为6组（每组6只）：1）空白组（0.5 μl生理盐水）；2）食欲素-A组（5 μg食欲素-A/0.5 μl生理盐水）；3）SB-334867组（20 μg SB-334867/0.5 μl生理盐水）；4）食欲素-A + SB-334867组（5 μg食欲素-A/0.25 μl SB-334867/0.25 μl生理盐水）；5）NTX组（0.5 μg纳曲酮/0.5 μl生理盐水）；6）食欲素-A + NTX组（5 μg食欲素-A/0.25 μl SB-334867/0.25 μl纳曲酮）。
向VTA注射食欲素-A显著增加了大鼠获得的食物颗粒数量（P < 0.05，图1 A）。
讨论
本研究发现，向VTA微注射食欲素-A可调节VTA DA神经元的放电频率并促进大鼠寻求美味食物的行为，而预先注射OX1-R拮抗剂SB-334867或同时注射NTX可完全阻断这种效应。因此，食欲素-A可能通过VTA DA神经元来促进寻求美味食物的行为，且μ-阿片受体信号通路可能参与其中。
作者贡献声明
栾晓：数据整理、正式分析、资金获取、方法学设计、验证、初稿撰写。
刘洋：数据整理、正式分析、项目管理、软件使用、监督、验证、初稿撰写。
张晓倩：概念构思、实验设计、项目管理、监督、验证、可视化。
孙向荣：概念构思、资金获取、方法学设计、资源协调。
郭菲菲：资金获取、方法学设计、资源协调。
利益冲突声明
我们声明没有财务利益冲突和利益相关问题。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：81470815、81270460、81300281、81500414和31971060）、中国博士后科学基金（项目编号：2018M632627、2018M630749）以及山东省优秀中青年科学家研究奖励基金（项目编号：BS2014YY009）的支持。
