综述：CHO细胞中重组治疗性蛋白质的糖基化调控策略

《Biochimie》：Glycosylation control strategies for recombinant therapeutic proteins in CHO cells

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产重组治疗蛋白（RTPs）的主要平台，其糖基化修饰直接影响蛋白功能、稳定性和免疫原性。本文系统分析CHO细胞中糖基化的生物学机制、影响其的关键因素（如宿主细胞特性、培养基成分、培养条件等），并探讨基因编辑和细胞培养优化等新型调控策略，为提高RTPs质量与批次一致性提供理论依据。

王伟峰|李卫东|王倩文|李学坤|王天云|张俊和

中原健康研究院，新乡医学院肿瘤药物筛选与靶向治疗重点实验室，中国新乡453003

摘要

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被广泛用作生产重组治疗蛋白（RTPs）的宿主细胞。糖基化是一种关键的翻译后修饰，显著影响在CHO细胞中表达的RTPs的功能和质量。这种修饰不仅影响蛋白质的折叠、稳定性和免疫原性，还决定了它们的生物活性和半衰期。本文总结了糖基化在CHO细胞中的生物学作用，分析了影响重组蛋白糖基化的内在和外在因素，并探讨了控制这一过程的最新策略，如基因编辑和细胞培养优化。这些方法为有效调节RTPs的糖基化模式提供了有希望的途径，从而提高其生物活性和稳定性。此外，我们还讨论了控制糖基化的当前挑战，并对这一领域的未来研究方向提供了见解。

引言

重组治疗蛋白（RTPs）在生物医学行业中至关重要，绝大多数获批准的RTPs都是在哺乳动物细胞系中生产的。[1] 值得注意的是，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是主要的生产平台，负责大约70%的市售RTPs [2]，[3]。CHO细胞因其多种优势而受到青睐，包括其在悬浮培养中的生长和存活能力、良好的安全性以及能够在无血清和化学定义的培养基中茁壮成长的能力 [4]，[5]，[6]。这些特性，加上其出色的表达能力、高生产稳定性和适合大规模制造的特点，使得CHO细胞成为首选的宿主系统。此外，与其他表达系统相比，CHO细胞具有进行复杂糖基化修饰的能力，产生的糖基化模式与人类细胞非常相似。这一特性对许多治疗蛋白的生物活性和稳定性至关重要 [7]，[8]。

为了使蛋白质正常发挥作用并发挥预期的生物效应，它们需要经过翻译后处理，这包括多种修饰，如磷酸化、泛素化、乙酰化和糖基化 [9]，[10]。特别是糖基化在蛋白质结构形成和功能中起着关键作用。但需要注意的是，并非所有重组蛋白都是糖蛋白。值得注意的是，一些较简单的结构也可以在微生物细胞宿主体内产生。蛋白质糖基化涉及一系列酶促和非酶促反应，其中蛋白质通过添加糖分子发生共价修饰，形成糖蛋白——这一过程包括美拉德反应 [11]。糖基化通常发生在蛋白质翻译的同时或之后。在各种酶的作用下，糖基或寡糖链被连接到多肽骨架上，随后被切割或重塑以生成多种糖基化结构。根据糖或糖链与蛋白质之间的连接方式，糖基化修饰可以分为四种主要类型：N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化和糖基磷脂酰肌醇（GPI）介导的糖基化 [12]。其中，N-糖基化是一种特别重要且研究较为深入的蛋白质糖基化形式。在体内，糖基化蛋白对于细胞粘附、分子识别和信号转导过程至关重要。糖基化影响多种细胞功能，包括细胞信号传导、免疫反应调节、蛋白质翻译和蛋白质降解 [13]，也是蛋白质生物活性的重要决定因素 [14]。此外，虽然糖鞘脂主要被归类为糖脂，但由于其糖链的复杂结构以及它们与细胞膜中糖蛋白的协同作用（例如在识别功能中的作用），有时也会在糖基化修饰的广泛讨论中被提及 [15]。这些不同类型的糖基化修饰显著增加了蛋白质结构和功能的多样性。

糖基化修饰在临床上具有重要意义，显著影响RTPs的产量和质量。其结构异质性是治疗蛋白的关键质量属性（CQA），直接决定了药物的临床疗效 [16]。非人类糖基化结构可能会引发免疫原性，从而危及临床安全性。此外，糖链的异质性会显著改变药代动力学特性，并影响批次间的一致性。在生物类似药开发中，精确表征糖基化谱对于证明与参考药物的临床可比性至关重要。因此，监管机构如FDA和EMA要求将其作为关键质量属性（CQA）进行监测 [17]，[18]。因此，优化糖基化控制策略既是工艺挑战，也是确保药物疗效、安全性和商业可行性的科学基础 [19]，[20]，[21]。针对特定应用（如增强抗肿瘤抗体的ADCC效应或延长EPO类似物的半衰期）定制糖链谱是生物制药研发的前沿。能够进行类似人类糖基化的CHO细胞通过人源化糖基化修饰为临床安全性和监管障碍提供了关键解决方案。因此，生物制药行业优先整合先进的糖工程技术和精确控制CHO细胞的糖基化，以提高产品质量。

部分摘录

糖基化的基本生物学功能

蛋白质糖基化是蛋白质与糖类之间的关键纽带。在蛋白质分子表面添加糖链会深刻影响其分子结构。这种修饰在维持蛋白质稳定性、影响其生物功能以及调节其免疫原性方面起着重要作用。

影响重组蛋白糖基化的因素

重组蛋白的糖基化受多种因素的影响，包括宿主细胞系、营养物质的可用性、培养方法和培养条件（图1）。其中，精确控制培养条件对于确保重组蛋白的糖基化一致性至关重要。培养条件，包括营养成分、pH值、温度、氧气和氨水平、渗透压以及剪切应力，都可能显著影响糖基化过程。

重组蛋白的糖基化控制

调控糖基化的机制非常复杂，涉及基因组学、系统生物学和质量控制等多个生物学层面。基因组学研究阐明了参与糖基化的关键基因和调控网络，为这一过程的精确操作提供了基础。系统生物学方法有助于全面理解细胞水平上的糖基化动态及其与

总结与展望

糖基化在生物制药行业中的重要性已经得到了充分认可。CHO细胞中的糖基化对重组蛋白的功能、稳定性、免疫原性和生物活性有着重要影响。这种翻译后修饰不仅影响蛋白质的折叠和分泌，还决定了其半衰期和生物活性，从而深刻影响治疗蛋白的安全性和疗效。多种因素共同调节糖基化过程。

作者贡献声明

张俊和：概念构思、监督、撰写——审阅与编辑。李卫东：正式分析、研究、撰写——初稿。王伟峰：概念构思、研究、撰写——初稿。王倩文：正式分析、研究、监督。李学坤：正式分析、研究、监督。王天云：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

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利益冲突声明

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：U23A20270）、河南省科技研发计划联合基金（工业领域）（编号：245101610004）、河南省自然科学基金普通项目（编号：252300423084、232300420019）以及河南省国际联合重组药用蛋白表达系统实验室开放项目（编号：KFKTYB202205）的支持。