《Bioresource Technology》：Continuous directed evolution of isoflavone synthase to mitigate feedback inhibition: combine use of a novel developed bacteria-based biosensor and high-throughput droplet sorting
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大豆苷元微生物合成受异黄酮合成酶（IFS）反馈抑制限制，本研究开发基于Bradyrhizobium japonicum FrrA转录因子的生物传感器，结合微流控分选和T7RNA聚合酶-脱氨酶融合蛋白连续定向进化策略，成功筛选出Trifolium pratense IFS的突变体M6，其抑制常数提高6.6倍，结合亲和力降低，使大豆苷元产量提升3.1倍。分子动力学模拟揭示关键突变位点的构象稳定机制。
王哲|赵丹山|Ghada Said Baghdady|王继远|戴一强|徐伟民|王道英|王月彤|夏秀东
江苏省农业科学院农产品加工研究所，南京 210014，中国
摘要
染料木黄酮（Genistein）是一种具有治疗氧化应激、心血管疾病和癌症潜力的生物活性异黄酮，但在微生物生物合成过程中，由于异黄酮合成酶（IFS）的产物反馈抑制作用，其生产受到限制。为了克服这一瓶颈，开发了一种基于生物传感器的连续定向进化平台。具体而言，利用Bradyrhizobium japonicum的转录因子FrrA构建了一种特异性染料木黄酮生物传感器，该传感器能够区分染料木黄酮及其前体（2’S）-naringenin。通过对生物传感器进行系统优化，在抑制染料木黄酮浓度下消除了背景荧光，同时保持了其对产物高水平的高响应性，从而实现了高通量筛选中的精确检测。通过将这种生物传感器与液滴微流控分选技术结合，通过脱氨酶-T7 RNA聚合酶融合介导的连续进化，生成了高质量的Trifolium pratense IFS（TpIFS）突变体文库，并对其进行了筛选。该方法成功鉴定出了TpIFSM6，这种突变体表现出6.6倍的产物抑制常数降低和3.8倍的染料木黄酮结合亲和力降低。因此，使用TpIFSM6获得的染料木黄酮产量是野生型的3.1倍。分子动力学模拟显示，I187R和F303A突变阻止了抑制剂诱导的催化I-螺旋构象位移。这项工作建立了一种可推广的高通量筛选策略，以减轻酶的反馈抑制，促进了植物来源天然产物的稳健生物合成。
引言
染料木黄酮是一种主要存在于豆科植物中的异黄酮，与其前体（2’S）-naringenin相比，具有显著的雌激素活性（Petry等人，2020年）。研究表明，它在缓解氧化应激（Li等人，2022a年；dos Petry等人，2020年）、更年期综合征（Tan等人，2025年）、心血管疾病（Wei等人，2022年）、骨质疏松症以及某些癌症（Geng等人，2022年；Neuberger等人，2023年）方面具有显著的治疗潜力。传统的植物提取方法受到较长栽培周期、严格的农艺要求以及天然含量低的限制。相比之下，微生物生物合成提供了一种可持续的替代方案，具有更高的产量、更短的生产周期和更少的环境限制（H. Li等人，2022年）。染料木黄酮从（2’S）-naringenin的生物合成由细胞色素P450酶异黄酮合成酶（IFS）催化（Hwang等人，2024年；Liu等人，2021年）。然而，IFS的活性受到其产物染料木黄酮的反馈抑制，这是防止代谢物积累的常见机制（Han等人，2016年；Leong和Hanson，2023年）。在微生物宿主中，这种反馈循环成为生产的主要瓶颈，因为积累的染料木黄酮浓度会抑制IFS活性，从而导致产量下降（Chemler等人，2010年）。我们之前的研究证实了这种直接的抑制效应，强调它是高效合成染料木黄酮的关键障碍（Wang等人，2022a年）。目前，对于染料木黄酮与IFS之间相互作用的理解仍然有限，特别是在它们的结合位点方面，这给合理和半合理酶设计带来了挑战。定向进化策略可以通过全局突变识别关键域，并利用远端突变的优势，为减轻酶的反馈抑制提供了一种有效方法（Sun等人，2023年；Zhang等人，2025年）。
传统的定向进化依赖于体外基因多样化，但往往受到劳动密集型协议和由于DNA转化效率低下导致的序列多样性有限的限制（Song等人，2025年）。为了克服这些限制，已经在E. coli中建立了体内连续定向进化系统，利用稳定的正交复制（Diercks等人，2025年；Song等人，2025年；Tian等人，2024年）。该系统的核心机制是使用胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶分别诱导随机的C到T和A到G突变（Mengiste等人，2024年；Park和Kim，2021年）。为了实现靶向突变，这些脱氨酶被融合到T7 RNA聚合酶（T7RNAP）中，使其特异性地作用于目标基因（Moore等人，2018年）。最近的一项进展涉及一种通用脱氨酶（GDE），它可以同时靶向脱氧腺苷和脱氧胞苷，从而实现更高效和更简洁的基因多样化系统（Mengiste等人，2024年；Neugebauer等人，2023年）。然而，尽管有这些先进的突变方法，仍然存在一个主要瓶颈：缺乏高效的筛选和富集所需性状的手段（Li等人，2025年；Yang等人，2025年）。对于IFS而言，缺乏一种高通量方法来鉴定抗反馈突变体仍然是一个关键障碍。因此，开发创新的筛选策略对于充分利用定向进化来工程化抗反馈的IFS至关重要。
基于微滴的高通量筛选是一种强大的工具，用于发现高性能酶，它依赖于具有高灵敏度和特异性的生物传感器产生的荧光信号（Yang等人，2025年；Zhang等人，2025年）。最近的进展表明，生物传感器引导的进化在优化代谢途径和缓解生产瓶颈方面是有效的（Li等人，2025年；Moon等人，2025年）。然而，由于染料木黄酮与其前体（2’S）-naringenin结构高度相似，开发针对染料木黄酮的生物传感器一直具有挑战性，这复杂化了特定信号识别（Chao等人，2023年）。一个有前景的解决方案是从根瘤菌中挖掘转录因子，因为根瘤菌天然暴露于异黄酮中。例如，Bradyrhizobium japonicum的转录因子FrrA可以特异性结合染料木黄酮以解除转录抑制，但对（2’S）-naringenin无反应，使其成为专用染料木黄酮生物传感器的理想候选者（Wenzel等人，2012年；Werner等人，2022年）。然而，仍然存在一个关键的设计挑战：在筛选抗反馈的IFS突变体时，培养基中必须存在外源染料木黄酮以施加抑制压力。因此，生物传感器需要精确调节灵敏度，以区分基础背景水平和表明酶活性增强的染料木黄酮浓度。这需要对生物传感器的动态范围进行严格控制，以最小化背景荧光并确保准确筛选。
在这里，我们提出了一种结合了优化生物传感器、连续定向进化和液滴微流控技术的综合工作流程，用于鉴定抗反馈的TpIFS突变体（图1）。为了确保高效筛选，构建了一种具有最小背景干扰的E. coli染料木黄酮生物传感器。随后，使用T7RNAP-GDE1嵌合体对TpIFS进行了连续定向进化，构建了一个高质量的突变体文库。利用该系统以及T7RNAP-GDE1嵌合体，成功分离出了抗反馈突变体TpIFSM6。此外，通过相互作用分析和分子动力学模拟阐明了这种抗性的结构基础。这项工作建立了一种稳健的体内选择策略，为抗反馈酶的高通量进化提供了可扩展的解决方案。
化学物质和试剂
使用E. coli DH5α进行质粒克隆，而E. coli BL21(DE3)及其衍生物作为表达宿主。微生物培养使用Luria-Bertani（LB）培养基。培养基中的氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、壮观霉素、l-阿拉伯糖、异丙基β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）和鼠李糖均购自Sangon Biotech（上海，中国）。所有基因操作程序均遵循T4 DNA连接酶、限制性内切酶提供的说明
染料木黄酮对TpIFS的非竞争性抑制
为了构建从前体（2’S）-naringenin到染料木黄酮的生物合成途径，选择了来自Trifolium pratense的TpIFS和来自Catharanthus roseus的细胞色素P450还原酶（CrCPR），因为这些成分在E. coli中表现出高活性（Chemler等人，2010年；Wang等人，2022a年）。（2’S）-naringenin经历IFS催化的2-羟基化和芳基迁移，生成不稳定的中间体2,4′,5,7-四羟基黄酮，随后在E.中自发脱水
结论
本研究开发了一种基于生物传感器的连续定向进化平台，以克服异黄酮生物合成中的关键反馈抑制瓶颈。通过将体内突变与响应染料木黄酮的生物传感器相结合，我们将染料木黄酮浓度转化为正相关的荧光信号，实现了超高效通量的液滴分选，有效克服了皮升级检测中的技术挑战。一个关键的创新是
CRediT作者贡献声明
王哲：撰写——原始草稿、可视化、形式分析、数据管理。赵丹山：撰写——审阅与编辑、方法学。Ghada Said Baghdady：撰写——审阅与编辑。王继远：形式分析。戴一强：可视化、数据管理。徐伟民：形式分析。王道英：形式分析。王月彤：方法学、资金获取、形式分析。夏秀东：方法学、资金获取、形式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢国家自然科学基金（项目编号：22478169 和 22508192）、国家重点研发计划（项目编号：2024YFA0918000）以及江苏省自然科学基金（项目编号：BK20231392 和 BK20230381）的财政支持。同时，我们也感谢Deggendorf理工学院BITZ转化实验室的Fidelis Azi博士在润色和修订手稿方面提供的帮助。
