饮食中的铜会导致斑马鱼（Danio rerio）发生铜中毒，并破坏其肠道-性腺轴的平衡

铜暴露对斑马鱼肠道-性腺轴的影响及cuproptosis机制研究。摘要：通过28天不同剂量铜（2.4-54.4 μg/g ww）膳食暴露成年斑马鱼，发现铜在组织中特异性积累（雌性1.7-7.7倍，雄性1.9-2.7倍），肠道与性腺离子稳态差异显著。转录组和蛋白分析揭示铜通过SLC31A1转运体干扰线粒体代谢（如fdx1、dlat、dlst酶活性下降52-74%），导致肠道病理（绒毛萎缩、杯细胞减少）和性腺发育延迟（雌性E2下降、雄性T升高），证实cuproptosis与肠-性腺轴功能障碍的关联。

　　

陈洪星|唐灿|黄凯乐|周文姬|娄成|吴芳莉|黄婷|罗永菊|谢凌天

华南师范大学环境研究所，广东省化学污染与环境安全重点实验室，教育部环境理论化学重点实验室，广州510006，中国

摘要

饮食暴露是金属毒性的一个公认途径，但其对水生生物的机制性影响仍知之甚少。本研究将五个月大的成年斑马鱼（Danio rerio，雌雄各半）暴露于不同浓度的铜（Cu）饮食中（2.4 μg/g ww（对照组），4.4 μg/g ww（Cu-L），9.8 μg/g ww（Cu-M）和54.4 μg/g ww（Cu-H）），持续28天，以阐明组织特异性铜积累、与铜死亡（cuproptosis）相关的毒性、肠道损伤、生殖效应以及这些效应通过肠道-生殖腺轴的潜在联系。在所有检测的组织中，雌雄鱼的铜浓度均显著升高，组织特异性变化范围为雌性1.7–7.7倍，雄性1.9–2.7倍，并且在肠道和生殖腺中观察到显著的离子稳态紊乱。转录组和蛋白质分析显示，与铜死亡相关的标志物受到组织特异性调控，其特征是线粒体酶（如fdx1、dlat、DLST）的广泛抑制（雌性大脑减少52–74%，生殖腺减少56–66%），同时铜转运蛋白SLC31A1的表达显著增加（1.6–5.4倍），表明铜稳态受到破坏，导致铜在细胞内滞留。高浓度铜暴露下，肠道组织病理学表现为绒毛萎缩和杯状细胞丢失，伴随性别依赖性的肠道微生物群失调，雌性的α多样性降低且属水平发生变化。此外，还观察到配子发生延迟、雌二醇（E2）水平降低、睾酮（T）水平升高以及下丘脑-垂体-生殖腺（HPG）轴相关基因的调控紊乱，雌性受影响更严重。这些发现表明铜死亡与肠道-生殖腺轴功能障碍之间存在机制性联系。本研究为饮食铜暴露的影响提供了新的见解，并强调了铜死亡在金属引起的内分泌和生殖紊乱中的生态学意义。

引言

铜（Cu）是一种必需的微量元素，参与水生生物的多种生理过程，包括线粒体呼吸、抗氧化防御和酶催化（Dawood, 2022; Handy, 2003）。然而，过量的铜暴露会导致细胞稳态紊乱，引发氧化应激、代谢功能障碍和严重的毒性（Gui and Wang, 2025a, b; Smriti et al., 2023）。例如，低至11 μg/L的铜浓度就会改变与氧化应激、线粒体功能和神经传递相关的关键蛋白质标志物，进一步表明即使在环境相关水平下，铜的毒性也较高（Green et al., 2024; Gui and Wang, 2025a）。由于采矿、农业、防污剂和工业废水的持续人为排放，铜污染仍然是淡水和沿海生态系统中的持续环境问题（Li et al., 2022; Xie et al., 2023）。铜释放到水生系统中后，会通过沉淀和吸附过程分布在水中和沉积物中（Besser et al., 2018）。在自然条件下，表层水中的铜浓度通常低于10 μg/L（Lee and Helsel, 2005）；然而，在严重污染的河流中，铜浓度可高达几毫克/升，例如孟加拉国的布里甘加河（Mohiuddin et al., 2011）。同样，未受污染的沉积物中铜浓度一般低于50 μg/g干重（dw）（F?rstner et al., 1990），而受采矿活动影响的沉积物（如美国的克拉克福克河）中的铜含量可能显著更高，范围为94至1540 μg/g dw（Cain et al., 2004）。因此，铜广泛存在于各种水生环境中，在高浓度下可能对栖息其中的生物构成重大生态风险。

在水生环境中，饮食暴露被认为是金属吸收的关键途径，尤其是对于底栖和杂食性鱼类（Yin et al., 2025）。与水传播暴露相比，食物链介导的铜转移可能导致持续的内部分布和组织特异性积累，从而引发慢性毒性效应，这些效应不能仅通过水中的铜浓度来预测（Luoma and Rainbow, 2005; Niyogi and Wood, 2003）。先前的研究表明，养殖的海鲷鱼（Terapon jarbua）在暴露于5.0–6.3 μg/g镉（Cd）饮食4周后表现出明显的组织特异性积累，镉优先在肝脏中积累，其次是消化道和鳃部，显示出器官间的金属分布差异（Dang and Wang, 2009）。然而，大多数先前的研究集中在全身生物积累或肌肉组织上，而器官特异性铜分布及其机制性毒理学后果仍不够明确。例如，一项野外研究发现，在中国辽东湾采集的海鱼中，环境暴露水平下的铜、铬、铅、锌、镉和镍表现出明显的组织特异性分布，肝脏、鳃和肌肉的金属转移模式与全身稀释趋势明显不同，强调了器官间金属积累和营养动力学的显著差异（Gao et al., 2021）。

最近，一种称为铜死亡（cuproptosis）的新调控细胞死亡形式被发现，其特征是铜直接结合到三羧酸循环中的脂酰化线粒体酶上，导致蛋白质聚集、蛋白质毒性应激和细胞死亡（Tsvetkov et al., 2022）。这一途径的关键分子成分包括铁氧还蛋白1（FDX1）、二氢脂酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）以及其他线粒体酶，如二氢脂酰胺S-琥珀酰转移酶（DLST）和乌头酸酶2/线粒体乌头酸水合酶（ACO2），这些成分共同将铜毒性与线粒体代谢联系起来（Lu et al., 2024a）。新兴证据表明，铜转运蛋白（CTR）的失调，包括高亲和力铜转运蛋白SLC31A1（CTR1）和铜外排转运蛋白ATP7A，在决定细胞内铜的可用性和对铜死亡的敏感性方面起着关键作用（Batzios et al., 2022; Kim et al., 2013）。研究表明，铜是一种可能干扰内分泌的金属，能够干扰鱼类的类固醇生成和生殖发育。先前的研究报道了铜诱导的雌二醇（E2）水平降低、睾酮（T）水平改变以及下丘脑-垂体-生殖腺（HPG）轴相关基因的转录紊乱（Cao et al., 2019; Handy, 2003）。然而，在水生生物实际暴露于铜的情境下，铜死亡与铜之间的因果关系仍不清楚。

肠道是金属饮食吸收的主要接口，越来越多地被认为是金属毒性的关键靶点。研究表明，铜暴露会导致淡水石斑鱼（Acrossocheilus fasciatus）（10–40 μg/L，30天）和幼年鲫鱼（Cyprinus carpio）（70–280 μg/L，8周）的肠道上皮损伤、屏障完整性破坏和肠道微生物组成改变，最终影响营养吸收和免疫功能（Meng et al., 2018; Wang et al., 2023b）。越来越多的证据表明，肠道菌群失调可以通过内分泌和代谢信号通路影响生殖性能，形成功能性的肠道-生殖腺轴（Ashonibare et al., 2024; Khan et al., 2022）。解决铜诱导的肠道损伤和微生物群失衡是否通过铜死亡相关机制导致生殖毒性的问题，对于全面理解铜暴露对鱼类健康的影响至关重要。

在本研究中，斑马鱼（Danio rerio）被暴露于铜饮食中28天，以系统地研究组织中的铜积累和毒性，重点阐明铜死亡与肠道-生殖腺轴功能障碍之间的潜在机制联系。通过整合分子、组织学、微生物学和内分泌学指标，本研究旨在为饮食铜暴露的系统性毒理学效应提供新的见解，并提高对金属诱导的生殖风险的机制理解。

化学品和试剂

五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O，CAS编号7758-99-8，纯度>98%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。所有使用的试剂均为分析级或更高级别。生化检测试剂盒购自建城生物工程研究所（中国南京）。实验前，所有玻璃器和塑料容器均浸泡在10%（v/v）硝酸中（Aladin，上海，中国）至少12小时，然后用超纯水彻底冲洗并在70°C下干燥。

铜污染食物的制备

铜在鱼类组织中的生物积累

饮食铜暴露后，雌雄斑马鱼的所有组织中的铜浓度均显著升高（图1A）。沉积物中的铜浓度增加了60倍（对照组3.27 μg/g dw vs Cu-H组193.40 μg/g dw），导致L. variegatus中的铜浓度增加了约23倍（对照组2.4 μg/g ww vs Cu-H组54.4 μg/g ww）。斑马鱼随后摄入这些蠕虫后，雌性的铜浓度增加了1.7–7.7倍，雄性增加了1.9–2.7倍，表明...

CRediT作者贡献声明

黄凯乐：数据可视化、验证、研究、数据管理。周文姬：数据可视化、方法学、研究、数据管理。唐灿：数据可视化、验证、研究、数据管理。陈洪星：初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、方法学、研究、资金获取、概念化。谢凌天：撰写-审稿与编辑、监督、资源协调、方法学、资金获取、数据管理、概念化。黄婷：

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（编号42377269、32460916、42230717）的财政支持。