《Glycoscience & Therapy》：Beyond the genome: GlycoRNAs as a nexus of glycobiology and RNA biology
编辑推荐：
研究人员针对长久以来认为糖基化仅限于蛋白质和脂质的认知局限，开展了对糖基化RNA（glycoRNA）这一新兴表观转录组修饰的系统性研究。该综述梳理了从代谢标记、富集技术到空间和单细胞分析的方法学演进，阐释了其以acp3U和O-聚糖为核心的结构特征，揭示了其在免疫调节（如通过P-选择素/Siglec-5介导白细胞募集）和癌症等疾病中的关键功能，并展望了其作为高精度诊断生物标志物和大分子治疗靶点的潜力。这项研究为理解生命信息传递的“副中心法则”及疾病诊疗开辟了新维度。
生命的“中心法则”（DNA → RNA → 蛋白质）描绘了遗传信息传递的经典路径，而糖基化（在蛋白质或脂质上添加糖链）则被视为此路径之外至关重要的“装饰”，深刻影响着蛋白质折叠、细胞识别与通讯。长久以来，科学界普遍认为糖基化是蛋白质和脂质的“特权”。然而，这一认知在近年被一项颠覆性的发现所打破：RNA，这一遗传信息的中间信使，竟然也能被糖基化。这种被称为“糖基化RNA”（glycoRNA）的新型生物分子，将共价连接的复杂聚糖“穿戴”在RNA骨架上，从而挑战了分子生物学的传统边界，并催生了一个连接糖生物学与RNA生物学的前沿交叉领域。
那么，这些“穿着糖衣”的RNA从何而来？它们如何在细胞中被合成和检测？它们具有怎样独特的结构？更重要的是，它们在生命活动中扮演何种角色，是与疾病作斗争的新线索，还是潜藏的治疗靶点？为了系统回答这些问题，研究人员在《Glycoscience》上发表了题为“Beyond the genome: GlycoRNAs as a nexus of glycobiology and RNA biology”的综述文章，对糖基化RNA的研究进展进行了全面梳理与展望。
为了深入研究糖基化RNA，研究人员发展并运用了一系列关键技术与方法。早期研究主要依赖于代谢标记与点击化学，即让细胞摄入带有化学标记（如叠氮）的糖前体，将其掺入新合成的糖基化RNA，再通过特异性化学反应连接报告分子进行检测。为了更精准地富集，后续开发了SPCgRNA（固相捕获N-糖基化RNA）和TnORNA（靶向Tn抗原的O-糖基化RNA）等化学酶法富集技术，其核心是利用半乳糖氧化酶氧化糖链末端的半乳糖或GalNAc，生成活性醛基进行固相捕获。在空间定位与成像方面，出现了ARPLA（适配体与RNA原位杂交介导的邻近连接检测）和HieCo 2（分层编码策略）等方法，实现了在单个细胞或活细胞中原位可视化特定的糖基化RNA。对于更高维度的分析，SUGAR-seq（表面蛋白聚糖与RNA测序）等单细胞多组学技术能够同时分析同一细胞的转录组、表面蛋白和N-聚糖谱。在结构解析层面，rPAL（RNA优化的高碘酸盐氧化和醛连接）结合SWATH-MS（序贯窗口采集所有理论质谱）质谱技术，揭示了糖链与RNA的共价连接位点。此外，研究还利用了来自癌细胞系、患者组织（如结肠癌、胰腺癌）及小鼠疾病模型的样本进行功能验证。
2. 糖基化RNA的鉴定技术
2.1. 通过代谢标记和点击化学的细胞合成途径
最初的研究利用叠氮修饰的唾液酸前体（Ac4ManNAz）对细胞进行代谢标记，再通过无铜点击化学连接生物素进行检测。该方法首次证明了小非编码RNA（如tRNA、Y RNA）可以携带N-聚糖并展示在细胞表面，其聚糖富含唾液酸和岩藻糖，提示其生物合成可能与经典蛋白质糖基化途径有相似之处。该方法无需预设糖基化RNA的存在，且通过使用不同的叠氮糖类似物可靶向不同类型的聚糖，具有通用性，但缺乏位点特异性分辨率。
2.2. 基于聚糖单糖氧化的糖基化RNA富集
为了从总RNA库中特异性富集糖基化RNA，研究人员开发了基于氧化的方法。SPCgRNA技术利用半乳糖氧化酶氧化糖基化RNA末端半乳糖/GalNAc产生醛基，进而通过固相胺反应捕获，再经糖苷酶消化释放，实现了对N-糖基化RNA的高效、高选择性富集。应用该技术于胰腺癌细胞系，发现了与正常细胞不同的独特RNA N-糖基化模式。优化后的SPCgRNA通过控制氧化条件和使用辣根过氧化物酶淬灭自由基，减少了RNA降解，成功从人结肠癌及癌旁组织中鉴定出多种N-糖基化小非编码RNA。类似的，TnORNA方法通过使用O-糖苷酶GalNAcEXO，可特异性富集携带Tn抗原的O-糖基化RNA，在胰腺癌中发现了如miR-103a-3p等调控癌症进展的O-糖基化miRNA。计算工具PONglyRNA的开发则能预测潜在的RNA糖基化位点，辅助实验验证。
2.3. 细胞糖基化RNA的空间与原位成像检测
成像技术为在原生细胞和组织环境中可视化糖基化RNA提供了可能。ARPLA技术联合使用聚糖结合适配体（如靶向唾液酸）和RNA特异性原位杂交探针，只有当两者同时结合同一目标分子时才会产生检测信号，实现了糖基化RNA的高特异性单细胞成像，揭示了其在乳腺癌恶性转化过程中的动态变化及与脂筏的共定位。HieCo 2策略通过分级DNA编码和杂交链式反应放大信号，能够在活细胞中原位可视化低丰度RNA（如Y5 RNA）的唾液酸化修饰，并精确定量单个RNA分子上的糖基化位点数。drFRET（双识别荧光共振能量转移）策略利用分别识别聚糖和RNA的核酸探针，可对微小细胞外囊泡表面的糖基化RNA进行高灵敏度成像与定量分析，在百人患者队列中展现出优异的癌症诊断潜力。
2.4. 单细胞水平的多组学策略整合
单细胞多组学技术能同时解析同一细胞的多个分子层面。SUGAR-seq技术可同步检测单个细胞的转录组、表面蛋白表位和N-聚糖，成功鉴定了肿瘤浸润T细胞中具有不同复杂N-聚糖特征的异质性亚群，并将特定的聚糖特征与细胞功能状态（如衰竭程度）和表观遗传特征相关联。在常染色体显性骨硬化症小鼠模型中应用SUGAR-seq，揭示了骨髓细胞中广泛的N-连接糖基化下调，并发现了与破骨细胞分化异常相关的单核细胞新亚型。
3. 糖基化RNA的共价连接
3.1. RNA-聚糖连接与聚糖类型的复杂性
目前，N-糖基化RNA的共价连接位点已被明确鉴定。通过rPAL富集结合质谱分析，证实N-聚糖共价连接在tRNA上经过修饰的尿苷acp3U（3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷）上，该修饰由DTWD酶家族催化生成。遗传敲除DTWD酶可显著降低糖基化RNA信号，证实了该结构基础的关键性。相比之下，O-聚糖被认为是糖基化RNA景观中主要且高度异质性的组成部分，多种证据表明O-聚糖存在于小非编码RNA上，但其在RNA上的精确核苷酸附着位点尚未解析，也缺乏通用的O-聚糖内切糖苷酶工具，这是该领域的一个重要未解难题。
3.2. 用于确定糖基化RNA结构的分析方法
rPAL方法能特异性标记末端唾液酸，富集天然的唾液酸化糖基化RNA用于质谱鉴定，是解析N-糖基化连接的关键工具。为克服其对唾液酸化物种的偏好，glycanDIA（聚糖数据非依赖性采集）等互补方法被用于检测非唾液酸化聚糖。通过整合多种代谢化学报告分子（靶向唾液酸、GlcNAc、GalNAc、岩藻糖）的研究，在经受严格RNase和蛋白酶处理的小RNA组分中仍能检测到稳定的信号，提示tRNA和snoRNA是主要的糖基化RNA骨架候选。功能研究中，通过差异代谢标记可将单细胞表面的糖基化RNA分为富含唾液酸的glycoRNA-L和富含GalNAc/GlcNAc的glycoRNA-S两类。
4. 糖基化RNA的生物学功能
4.1. 糖基化RNA在炎症和免疫调节中的作用
细胞表面展示的糖基化RNA是先天免疫的重要调节者。研究发现，糖基化RNA可作为P-选择素（SELP）的配体，介导中性粒细胞与内皮细胞的粘附和迁移，从而调节中性粒细胞向炎症部位的募集，该过程依赖于SID-1同源蛋白。在先天免疫中，糖基化RNA扮演着“双面角色”：一方面，其糖链结构可能作为病原体相关分子模式被识别，触发免疫反应；另一方面，更关键的是，其N-聚糖可对免疫原性RNA基序形成“屏蔽”，防止TLR3、TLR7等先天免疫感受器的异常激活，这是实现免疫逃逸、避免自身免疫的关键机制。此外，单细胞表面的glycoRNA-L和glycoRNA-S可通过与内皮细胞上的Siglec-5（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5）结合，促进单核细胞粘附，在炎症调节中发挥作用。在神经免疫中，神经元表面的糖基化RNA可作为小胶质细胞上Siglec-11的配体，抑制神经炎症，发挥神经保护作用。
4.2. 糖基化RNA在癌症生物学中的发现
糖基化RNA的表达与癌症恶性程度相关。利用ARPLA成像技术发现，在乳腺癌细胞系中，细胞表面糖基化RNA的水平与细胞恶性表型和转移潜能呈负相关。在胰腺癌中，特定的O-糖基化miRNA（如miR-103a-3p）可通过PI3K-Akt通路调控癌细胞生长。糖基化RNA可能通过影响细胞粘附、与肿瘤微环境相互作用以及调节信号通路等方式参与癌症进展。其异常表达可能成为癌症的新型生物标志物。
4.3. 糖基化RNA在疾病诊断与治疗中的潜力
凭借其位于细胞外/囊泡表面的特性和兼具聚糖与RNA的双重生化特性，糖基化RNA在疾病诊断中展现出巨大前景。drFRET策略对微量生物流体中小细胞外囊泡糖基化RNA的检测，在区分癌症与非癌症、以及癌症分型中显示出高准确度。在治疗方面，糖基化RNA本身可作为治疗靶点。例如，在腹主动脉瘤模型中，研究人员构建了富含糖基化RNA的中性粒细胞膜包被纳米颗粒，该颗粒能靶向炎症部位，通过竞争性抑制中性粒细胞聚集并递送治疗性siRNA，实现了精准治疗，展示了以其为基础构建新型药物递送平台的潜力。
5. 总结与展望
糖基化RNA的发现是糖生物学和RNA生物学领域的革命性进展，它确立了一类新的表观转录组修饰，并提出了与“中心法则”并行的“副中心法则”概念。方法学上，该领域已从初期的代谢标记发展到高选择性的富集、高分辨率的空间成像及单细胞多组学整合。结构上，N-聚糖与tRNA上acp3U的共价连接已被证实，而O-聚糖构成了其景观中主要且异质性的部分。功能上，糖基化RNA是免疫和疾病的关键调节因子，通过作为P-选择素、Siglec等受体的配体介导免疫细胞募集与粘附，并通过聚糖“屏蔽”机制在先天免疫中扮演双重角色。
尽管取得了这些基础性发现，该领域仍面临诸多挑战，包括需要排除糖蛋白信号干扰、开发通用的O-聚糖内切酶、实现低丰度糖基化RNA的超灵敏检测等。未来研究需优先解析其精确的生物合成与运输机制，开发正交标记化学和聚糖结构特异性探针，并利用人工智能等先进计算模型解读其复杂性。鉴于糖基化RNA的异常表达与疾病（如癌症、心血管疾病、炎症）密切相关，且位于细胞外，它们极有希望发展成为新一代高精度诊断生物标志物和大分子治疗靶点。持续的技术创新与深入的功能研究，对于实现糖基化RNA在革新疾病诊疗范式、解决肿瘤生物学与免疫互作复杂性方面的潜力至关重要。
