《Chinese Medicine and Culture》：Innovative Technologies: Optimizing Nursing Practice
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本研究发现，结合肠道菌群与血清免疫球蛋白G（IgG）亚类（IgG1/IgG2）糖基化特征构建的联合评分模型，能有效识别代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者的严重肝脏脂肪变性（HS）和显著肝纤维化，其诊断效能不劣于现有肝脂肪变指数（HSI）和纤维扫描-天冬氨酸氨基转移酶（FAST）评分，为无创、精准评估MASLD病情进展提供了新思路。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为美国肝移植候选者及受者中肝细胞癌（HCC）增长最快的原因。肝活检是评估肝纤维化的金标准，但具有侵入性、观察者间差异、采样误差等局限。现有非侵入性模型，如肝脂肪变指数（HSI）和纤维扫描-天冬氨酸氨基转移酶（FAST）评分，虽被广泛应用，但其依赖的天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平易受多种治疗影响，且纤维扫描操作依赖性强、需要特定设备。因此，迫切需要开发不依赖易变和操作者依赖性工具的新型评估模型。
近期研究强调了肠道菌群与慢性肝病（CLDs）的关系。同时，免疫球蛋白G（IgG）的N-糖基化作为一种翻译后修饰，在CLDs中受到关注，因为肝脏是糖蛋白合成的主要器官，会导致糖基化模式改变。肠道菌群失调与IgG糖基化改变均在慢性炎症性疾病的发展中起关键作用。本研究旨在利用IgG糖基化特征和微生物联合体，开发用于识别MASLD患者严重HS和显著肝纤维化的组合模型。
研究方法
本研究为横断面研究，招募了2023年5月至2024年10月期间因疑似脂肪肝接受腹部超声检查的20岁以上个体。MASLD定义为经组织学或放射学证实的HS，且至少存在一项心脏代谢风险因素。排除标准包括近期接受过免疫调节剂、细胞毒性药物、化疗、类固醇或抗生素治疗，以及可能妨碍准确测量的不稳定状况。
通过瞬时弹性成像（FibroScan）评估HS，受控衰减参数（CAP）值≥292 dB/m表示严重HS。通过FIB-4指数评估肝纤维化风险，FIB-4 ≥1.3表示存在显著肝纤维化的高风险。使用液相色谱/质谱（MS）分析血浆样品中纯化的总IgG及其糖基化特征。粪便样本通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群。
统计分析包括使用微生物丰度差异和IgG糖基化特征比值建立预测严重HS和显著肝纤维化的评分模型，并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估其分类能力。
结果：肠道菌群特征及其预测模型
研究共纳入111名MASLD患者和29名非MASLD个体进行分析。在MASLD患者中，根据CAP水平分层显示，高CAP组（严重HS）的甘油三酯水平显著升高，白蛋白水平降低。根据FIB-4指数分类显示，高FIB-4组（显著纤维化）的天冬氨酸氨基转移酶（AST）、糖化血红蛋白（HbA1c）水平升高，糖尿病患病率更高。
研究发现，与非MASLD个体相比，MASLD患者中有12种细菌的丰度显著更高。具体而言，在低CAP（非严重HS）的MASLD患者中，Eubacterium eligens、Clostridia UCG-014等物种丰度显著更高，被归类为非严重HS相关细菌。相比之下，Megamonas在高CAP（严重HS）的MASLD患者中占主导地位，被归类为严重HS相关细菌。
基于这些细菌的丰度临界值，通过累加严重和非严重HS相关细菌的得分，建立了预测严重HS的微生物联合体评分。ROC分析显示，该评分预测严重HS的曲线下面积（AUC）为0.731（敏感性0.855，特异性0.571）。
在肝纤维化方面，Weisella在低FIB-4（非显著纤维化）患者中占主导，而Christensenellaceae R-7、UCG-005、CAG-56和Lachnospira在高FIB-4（显著纤维化）患者中更普遍。通过累加非显著和显著纤维化相关细菌的得分，建立了预测显著肝纤维化的微生物联合体评分，其AUC为0.773（敏感性0.538，特异性0.864）。
结果：IgG亚类糖基化特征及其与菌群的关联
调整年龄和性别后，MASLD患者中低CAP组与高CAP组之间、低FIB-4组与高FIB-4组之间，部分IgG1和IgG2糖基化特征存在显著差异。
在低CAP的MASLD患者中，非严重HS相关糖基化特征与微生物联合体（如Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus）之间存在5个正相关。相反，Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus与严重HS相关糖基化特征呈3个负相关。值得注意的是，Megamonas在低CAP组中与严重HS相关糖基化特征无关联，但在高CAP组中与多个特征呈正相关。
在高FIB-4患者中，非显著纤维化相关细菌Weisella与非显著纤维化相关糖基化特征IgG2-N4H4F1呈正相关。而在低FIB-4组中未观察到相关性。这些结果表明，微生物联合体与糖基化之间复杂的相互作用可能影响HS和显著肝纤维化的发展。
结果：IgG1与IgG2糖基化特征的相互关联及预测模型
分析低CAP和高CAP组中IgG1和IgG2糖基化特征间的相互关联，发现了数个中度至高度的正相关，尤其在非严重HS患者中。有三对呈正相关的糖基化特征在低CAP和高CAP组中均保持稳定关联：IgG1-N4H3F1与IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1与IgG2-N4H5F1、以及平分型（bisected）-IgG1与平分型-IgG2。
同样，在低FIB-4和高FIB-4组中，有四对呈正相关的糖基化特征始终保持稳定关联：IgG1-N4H3F1与IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1与IgG2-N4H5F1、平分型-IgG1与平分型-IgG2、以及IgG1-半乳糖基化指数（Galactosylation Index）与IgG2-半乳糖基化指数。
聚焦于在低CAP和高CAP组中均稳定呈正相关的糖基化特征，评估其比值作为识别严重HS的候选指标。结果显示，IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1和平分型-IgG2/平分型-IgG1的比值能够识别严重HS。而IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1的比值则不能识别严重HS。
类似地，对于识别显著肝纤维化，稳定呈正相关的特征比值，包括IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、平分型-IgG1/平分型-IgG2和IgG1-半乳糖基化指数/IgG2-半乳糖基化指数，均表现出识别能力。然而，IgG1-N4H5F1/IgG2-N4H5F1的比值不能识别显著肝纤维化。
结果：结合微生物与糖基化特征的联合评分模型
为评估微生物联合体和糖基化特征对识别MASLD患者严重HS和显著肝纤维化的综合作用，研究者开发了结合微生物评分和糖基化特征比值的联合评分。
对于识别严重HS，若IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1或平分型-IgG2/平分型-IgG1的比值超过各自临界值，则计1分。严重HS联合评分由糖基化特征比值得分与严重HS-微生物联合体评分相加得出。该联合评分的AUC为0.776，高于肝脂肪变指数（HSI）的AUC（0.645）。
类似地，通过累加显著肝纤维化-微生物联合体评分和糖基化特征比值（IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、平分型-IgG1/平分型-IgG2、IgG1-半乳糖基化指数/IgG2-半乳糖基化指数）计算显著肝纤维化联合评分。该联合评分识别显著肝纤维化的AUC为0.810，高于FAST评分的AUC（0.690）。
除了与现有模型HSI和FAST评分进行交叉验证外，使用10折自助法（bootstrap）进行的内部验证也显示了良好的AUC曲线，校准曲线的Hosmer-Lemeshow检验P值分别为0.109和0.797，表明模型拟合良好。
讨论
近年研究强调了IgG-GlcNAc相对非半乳糖基化与内脏脂肪沉积之间的关联，而内脏脂肪沉积又与MASLD患者的HS和纤维化相关。IgG的低半乳糖基化也与儿科MASLD患者的肝脏炎症有关。本研究发现，MASLD患者中IgG2的低半乳糖基化指数与严重HS和显著肝纤维化显著相关。值得注意的是，IgG1和IgG2之间特定的糖基化特征比值成为了这些患者严重HS和显著肝纤维化的潜在预测因子。
肠道菌群的改变与MASLD的发病机制有关。肠道细菌Megamonas的丰度增加与MASLD的发展相关，本研究进一步建立了Megamonas与严重HS的联系。先前研究表明Eubacterium和Lachnospiraceae水平降低与HS相关；本研究支持这些物种的丰度随着HS严重程度进展而减少。此外，肠道微生物联合体的变化与MASLD中肝纤维化的进展相关。我们确定了特定的微生物联合体以及糖基化特征比值可作为MASLD严重程度（特别是严重HS和显著肝纤维化）的潜在预测因子。
本研究中IgG亚类的糖基化特征与严重HS和显著肝纤维化显著相关。针对糖基化的干预措施已在抗癌疗法中进行探索，目前有临床试验正在评估其疗效。与我们的发现一致，微生物联合体在各种炎症条件下影响IgG糖基化。此外，通过粪便微生物群移植改变微生物联合体，已显示出通过改变血清N-糖基化模式来减轻慢性炎症的潜力。因此，通过益生菌改变肠道微生物联合体来修饰IgG糖基化，可能减轻HS和脂肪性肝炎。
与已建立的预测模型（如HSI和FAST评分）相比，我们的组合模型在预测本队列中的严重HS和显著肝纤维化方面表现出相当的效能。值得注意的是，HSI和FAST评分中的血清AST水平对肝脏疾病缺乏特异性，并可能受多种因素影响。HSI在区分严重脂肪变性方面存在局限，且可能因并发纤维化而产生混淆。此外，FAST评分测量需要纤维扫描等专用设备，操作复杂。相比之下，我们的联合评分仅依赖于易于获取的血清和粪便样本，并可同时检测严重HS和显著肝纤维化，便于样本收集和MASLD严重程度的综合评估。
本研究存在一些局限性，主要集中于主要IgG亚类（IgG1和IgG2）的糖基化。未来研究应调查IgG3和IgG4的糖基化以提供更全面的理解。此外，MASLD与非MASLD之间、以及高CAP与低CAP组之间的饮食构成（如热量、纤维摄入、加工食品等）可能不同，这可能会影响组间肠道菌群的差异。因此，未来研究需要探索饮食构成对组间肠道菌群的影响。尽管纤维扫描存在成本和可及性限制，但粪便微生物群和血清IgG糖基化分析因不同实验室能力差异和保险适用性，在临床上也不易获得。但本研究的初步结果仍可作为进一步肝纤维化药理学和病理学探索的基础。
在我们的研究中，与现有模型的交叉验证、10次内部验证以及校准曲线均证实了该模型在识别MASLD病例中严重HS和显著肝纤维化的准确性。尽管如此，有限的样本量阻碍了纳入验证队列，并且估算的中等效应量为0.65，需要在后续大规模研究中对这些模型进行进一步的外部验证。尽管存在这些局限性，我们的发现通过校准曲线证实了IgG糖基化特征与MASLD严重程度之间存在显著关联，强调了糖基化修饰作为一个有前景的治疗途径值得进一步探索。
结论
本研究表明，利用粪便微生物群和血清IgG亚类糖基化特征构建的组合模型具有识别严重HS和显著肝纤维化的潜力，其效能不劣于传统模型。此外，该研究强调了糖基化修饰作为MASLD一种潜在治疗方法的可能性。
