《Frontiers in Physiology》：Single-cell transcriptomics reveals heterogeneous neutrophil populations and diagnostic biomarkers in atherosclerosis
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本研究整合多个人类动脉粥样硬化样本的单细胞RNA测序数据，结合生信分析、动物模型验证及机制探索，揭示了中性粒细胞在该疾病中的异质性及其关键调控基因。研究发现，CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1这四个基因在动脉粥样硬化病变中特异性高表达，可作为区分疾病状态与健康状态的潜在诊断标志物（AUC > 0.85）。实验证明，这些基因与巨噬细胞等免疫细胞浸润及NF-κB、Toll样受体、铁死亡等炎症和代谢通路密切相关，并通过药物重定位分析预测了NU-7441等潜在治疗化合物。该研究为理解动脉粥样硬化的细胞异质性、发现新的诊断靶点和治疗策略提供了重要依据。
引言
动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是一种累及动脉壁的慢性炎症性疾病，是全球死亡的主要原因，可导致冠心病、中风和外周动脉疾病等多种心血管疾病。其进展涉及内皮功能障碍、氧化低密度脂蛋白沉积以及包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞在内的多种免疫细胞的复杂相互作用。这些细胞通过分泌细胞因子和趋化因子促进斑块形成和不稳定。尽管针对炎症因子和趋化因子的抑制剂等免疫疗法靶点已被确定，但其疗效可能取决于动脉粥样硬化病变内免疫细胞的异质性组成和功能状态。单细胞RNA测序技术为解析这种异质性提供了强大工具，然而，中性粒细胞在病变中的异质性及其在疾病进展中的作用仍不清楚。
材料与方法
研究整合了来自三个公开数据集的数据，其中单细胞RNA测序数据集GSE159677包含来自3名接受颈动脉内膜切除术患者的6个样本。此外，还使用了两个批量微阵列数据集GSE28829和GSE43292作为验证集。对单细胞数据，研究使用Seurat包进行质控、归一化和降维分析，并应用Harmony算法校正批次效应。通过UMAP可视化，共鉴定出16个不同的细胞亚型。使用CellChat软件包分析细胞间通讯网络。为了构建中性粒细胞亚型特异性的基因共表达网络，研究进行了高维加权基因共表达网络分析，并利用Lasso回归筛选特征基因。使用GSE28829数据集作为独立外部验证集评估了基于四个特征基因构建的风险预测模型的诊断性能，并通过CIBERSORT算法分析免疫细胞浸润情况。通过基因集富集分析和基因集变异分析探究关键基因的生物学功能和潜在调控机制。此外，研究利用RcisTarget包预测调控关键基因的转录因子，并使用Connectivity Map数据库进行药物预测。为验证关键基因的表达，研究分别构建了ApoE?/?小鼠和高脂饮食联合维生素D3注射的SD大鼠动脉粥样硬化模型，并通过实时定量PCR、Western blot、组织染色和磁共振成像等技术进行了体内验证。
结果
细胞图谱构建与中性粒细胞异质性分析
对47，604个细胞进行分析后，研究确定了16个细胞亚群，注释为T淋巴细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤T细胞、B淋巴细胞、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞等九大类。与配对的邻近组织相比，动脉粥样硬化斑块核心组织中中性粒细胞的比例显著增加。对中性粒细胞亚群的进一步细分显示，其中多个亚群在病变组织中比例上升。细胞通讯分析揭示了这些细胞亚型之间存在复杂的配体-受体相互作用对。
关键基因的鉴定与验证
通过对中性粒细胞亚型进行hdWGCNA分析，构建了基因共表达网络，鉴定出七个模块。其中黑色和黄色模块的模块特征基因在动脉粥样硬化相关的细胞亚型中表达水平显著升高。从这两个模块中提取排名前25的基因作为候选基因，随后使用Lasso回归在训练集GSE43292中进行特征筛选，最终确定了四个核心特征基因：CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1。
基于这四个基因构建的风险评分模型（RiskScore = CSTB × 0.0122 + CHST15 × 0.0424 + RNASE1 × 0.1121 + ATP2B1 × 0.1297）在训练集和独立外部验证集GSE28829中均表现出优异的诊断性能，曲线下面积分别达到0.8721和0.8606。
动物模型实验进一步验证了这些基因在病变组织中的高表达。在ApoE?/?小鼠和高脂饮食诱导的SD大鼠动脉粥样硬化模型中，与对照组相比，病变颈动脉组织中这四个基因在mRNA和蛋白水平的表达均显著上调。
关键基因与免疫微环境及信号通路的关系
单细胞数据表达分析显示，CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1在多种免疫和血管细胞类型中均有表达。免疫浸润分析表明，与对照组相比，疾病组中M0型巨噬细胞的比例显著更高。相关性分析发现，这四个关键基因与多种免疫细胞的浸润水平显著相关。例如，CHST15、CSTB和RNASE1的表达与M0巨噬细胞呈正相关，而与CD8 T细胞呈负相关。这些基因还与多种免疫抑制因子、免疫刺激因子、趋化因子及其受体的表达显著相关。
基因集富集分析揭示了这些基因参与的关键信号通路。ATP2B1显著富集于B细胞受体信号通路、NF-κB信号通路和Toll样受体信号通路。CHST15显著富集于抗原加工与呈递、Fc epsilon RI信号通路和铁死亡通路。CSTB显著富集于胞质DNA感知通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路。RNASE1则显著富集于脂质与动脉粥样硬化通路、NOD样受体信号通路和TNF信号通路。
基因集变异分析进一步证实，高表达这些基因的样本中，与免疫反应、炎症反应和氧化应激相关的通路被激活。例如，高表达CHST15的样本富集于活性氧通路、IL6 JAK STAT3信号和炎症反应通路；高表达CSTB的样本富集于同种异体移植排斥、活性氧通路和炎症反应通路。
转录调控与潜在治疗药物预测
转录因子结合motif富集分析发现，这四个关键基因的启动子区域存在共同的、过度富集的顺式调控基序，提示它们可能受一组特定转录因子的共同调控。相关性分析显示，关键基因与已知的动脉粥样硬化调控基因存在显著关联，例如CHST15与ALOX5呈显著正相关，而CSTB与APOB呈显著负相关。
基于疾病与对照样本的差异表达基因谱，通过Connectivity Map数据库进行药物重定位分析，预测出NU-7441、戈舍瑞林、大观霉素和MRS-1220等几种小分子化合物，其表达谱与疾病特征谱呈显著负相关，提示它们可能具有逆转疾病状态的潜力，是潜在的抗动脉粥样硬化候选药物。
讨论
本研究通过单细胞转录组分析，在三个方面为动脉粥样硬化研究领域做出了贡献：详细描述了病变内中性粒细胞的异质性；确定了四个有潜力的诊断生物标志物基因；并初步阐明了疾病进展的可能分子通路。研究发现病变动脉中中性粒细胞比例升高，这与该细胞在动脉粥样硬化发生中的关键作用一致。所鉴定的CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1这四个基因在独立队列中验证了其诊断价值。
CSTB编码的胱抑素B已被提议作为血浆中的心血管疾病生物标志物，本研究发现其与APOB呈负相关，提示了其在脂质代谢中的新调控机制。CHST15与ALOX5的强正相关，揭示了其在调节氧化应激和铁死亡中的潜在新轴。RNASE1对维持血管稳态至关重要，其敲低已被证明可减少动脉粥样硬化斑块形成。ATP2B1编码质膜钙ATP酶1，对维持细胞内钙稳态至关重要，其功能异常会影响血管平滑肌细胞收缩性。
机制上，这些基因与M0巨噬细胞等免疫细胞浸润显著相关，并富集于NF-κB、Toll样受体、IL-17、NOD样受体、TNF以及铁死亡等与动脉粥样硬化病理生理直接相关的信号通路。药物预测结果为开发新的疗法提供了线索。然而，本研究也存在一些局限性，例如动物模型不能完全模拟人类疾病的复杂性，诊断模型需要在更大规模的前瞻性临床队列中进一步验证，以及研究主要聚焦于中性粒细胞，可能忽略了与其他细胞类型的重要相互作用。
结论
本研究揭示了中性粒细胞与动脉粥样硬化进展之间的关联，确定了ATP2B1、CHST15、CSTB和RNASE1是这一调控网络中的关键因子，并初步探索了相关的分子通路。这些基因与特定免疫细胞存在正或负相关，可能影响动脉粥样硬化的免疫微环境。未来需要在适当的模型和前瞻性临床队列中开展功能研究，以严格验证这些关键基因作为不稳定斑块诊断标志物的作用，并深入探究它们与已知调控基因相互作用影响疾病进展的具体机制。总之，该研究为动脉粥样硬化不稳定斑块的诊断和治疗提供了新的见解，并为探索疾病进展的相关基因和分子机制提供了新的视角。
