《Frontiers in Immunology》：Macrophage-derived CCL20 promotes abdominal aortic aneurysm progression via lymphocytes CCR6
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本研究整合单细胞与转录组测序、临床队列与动物模型，系统揭示了腹主动脉瘤（AAA）中巨噬细胞极化失衡（M1-like表型富集）导致CCL20高表达，进而通过CCL20-CCR6轴招募CCR6+T/B淋巴细胞，加剧血管壁免疫浸润与结构破坏，促进AAA进展。研究提出CCL20可作为AAA潜在生物标志物，干预该轴为AAA治疗提供了新策略。
3.1 AAA中免疫细胞浸润与结构细胞耗竭
通过对GEO数据库中两份人腹主动脉单细胞RNA测序数据集（GSE166676与GSE226492）的分析，研究共获得67,656个细胞（正常组39,782个，AAA组27,874个），并注释为11种主要细胞类型。与正常组相比，AAA组织中结构性细胞比例显著降低：成纤维细胞从34.63%降至11.52%，内皮细胞从17.59%降至3.89%，平滑肌细胞（SMCs）从12.95%降至1.66%。相反，免疫细胞如T细胞（从3.84%增至22.35%）、B细胞（从1.92%增至29.59%）和自然杀伤T（NKT）细胞（从2.39%增至7.14%）显著富集，而巨噬细胞比例变化不大（从13.14%到13.54%）。观察值与期望值之比（Ro/e）分析进一步显示，结构性细胞在AAA组中代表性不足，而免疫细胞（T细胞、B细胞、NKT细胞）则显著倾向于富集在AAA组织中。免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色在人体主动脉组织中也证实了T细胞和B细胞的富集。这些结果表明AAA组织存在深刻的细胞失衡，其特征是广泛的免疫细胞浸润（T细胞和B细胞）和结构性细胞（成纤维细胞、内皮细胞和SMCs）的丢失。
3.2 AAA中炎症与免疫反应被激活
对两份人腹主动脉瘤批量RNA测序数据集（GSE183464和GSE269845）的分析显示，AAA与正常组织之间存在显著的转录组异质性。差异表达基因（DEGs）分析发现，上调基因（如CCR7、CXCR4、CD79A）与免疫反应、免疫细胞激活和细胞通讯相关，而下调基因（如ACTC1、COL4A3、ACTN2）则与血管结构和细胞骨架组织相关。两个数据集中共有589个基因一致上调，449个基因一致下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，上调基因富集于炎症过程、免疫激活和细胞因子趋化性，而下调基因则与细胞外基质降解和平滑肌收缩相关。基因集富集分析（GSEA）进一步证实，免疫相关通路（如B/T细胞受体信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号和脂质代谢）在AAA中显著激活；而与主动脉结构相关的通路（如细胞外基质-受体相互作用、SMC细胞骨架和血管平滑肌收缩）则受到抑制。这些结果证明AAA组织表现出增强的炎症和免疫反应，并伴有血管壁完整性的破坏。
3.3 巨噬细胞极化影响AAA进展
为识别与AAA进展相关的细胞类型，研究使用Scissor算法分析了批量RNA测序数据。结果显示，在AAA组中，巨噬细胞含有更高比例的Scissor+细胞，而平滑肌细胞（SMC）则含有最高比例的Scissor-细胞，表明巨噬细胞在AAA发病机制中起关键作用。然而，单细胞数据分析和IHC染色显示，AAA组与正常组之间的巨噬细胞比例并无显著变化。使用CIBERSORTx对免疫细胞亚群组成的分析发现，在两个数据集的AAA组中，M2巨噬细胞的比例均显著降低。单细胞数据集分析显示，AAA组的M1样巨噬细胞特征模块评分上调，而正常组的M2样巨噬细胞模块评分更高。此外，AAA组中的巨噬细胞表达升高的M1样巨噬细胞特征基因，而正常组则表达更高的M2样巨噬细胞特征基因。免疫荧光染色显示，健康人主动脉中CD204（MSR1）高表达，而AAA组织中CD86表达水平更高。通过多重免疫荧光染色进一步表征巨噬细胞极化，在人类样本中，具有促炎M1样特征的巨噬细胞被鉴定为CD68+CD86+iNOS+，具有抗炎M2样特征的巨噬细胞被鉴定为CD68+CD163+CD206+。结果显示，AAA样本中的巨噬细胞表现出更强的M1样功能特征，而正常样本中的巨噬细胞则高表达M2标志物。这些发现表明，虽然巨噬细胞比例变化不大，但M1样与M2样巨噬细胞极化之间的失衡可能影响AAA的进展。
3.4 AAA中巨噬细胞基因表达改变并伴随大量CCL20分泌
对巨噬细胞进行差异表达基因分析发现，与正常组相比，AAA巨噬细胞中有139个基因上调，105个基因下调。GO和KEGG通路富集分析表明，上调基因与生物过程（如趋化性、细胞趋化、免疫和炎症反应）以及通路（如TNF信号通路、PPAR信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路等）显著相关。GSEA进一步证实这些过程和通路在AAA组中被激活。在人AAA组织中进行实时定量PCR验证，结果显示与免疫反应和趋化相关的基因（IL-1β、IL-8、TNF-α）表达升高。脂质代谢相关标志物（ACC1、FASN、PPAR-γ）的表达水平也升高。油红O染色也显示动脉瘤中有明显的脂质沉积。这些结果表明AAA中的巨噬细胞具有炎症和脂质积累特征。在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中，IL-1α、CXCL10和CCL20是巨噬细胞中上调最多的三个因子。单细胞数据显示，CCL20在所有分析的11种细胞类型中主要在巨噬细胞中高表达。免疫荧光共定位进一步证实CCL20主要存在于巨噬细胞中。与正常组相比，CCL20在AAA组织巨噬细胞中的表达显著升高，这在批量RNA测序数据集中也很明显。考虑到CCL20的分泌特性及其先前已验证的诊断效用，研究收集了80名AAA患者和79名健康对照的血清样本进行酶联免疫吸附试验（ELISA）分析。结果显示，AAA患者的CCL20水平显著高于健康对照，曲线下面积（AUC）值为0.7。此外，对英国生物样本库（UK Biobank）数据的分析显示，在52,017名参与者中，经过中位13.59年的随访，确定了329例AAA事件。多变量Cox回归结果显示，循环CCL20水平每增加1个标准差，AAA风险相应增加。与CCL20最低四分位数（Q1）的参与者相比，最高四分位数（Q4）的参与者发生AAA的风险增加了44%。人AAA组织中CCL20的表达也高于正常腹主动脉组织。这些发现表明，CCL20主要由AAA中的巨噬细胞分泌，在组织和血液中水平升高，可能参与AAA的进展。
3.5 巨噬细胞通过CCL20-CCR6轴招募大量免疫细胞
由于CCR6是CCL20的唯一受体，研究可视化了其在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中的相互作用关系。单细胞数据显示，CCR6主要在T细胞和B细胞中表达，这一发现在人AAA组织的免疫荧光共定位中得到证实。比较分析显示，AAA组织中T细胞和B细胞的CCR6表达显著升高。蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光分析进一步证明人AAA组织中CCR6表达更高。同样，批量RNA测序数据中CCR6 mRNA水平上调。因此，CCR6在AAA组织中表达升高，主要存在于T细胞和B细胞中。为了探索AAA过程中巨噬细胞介导的潜在趋化因子通讯，研究使用CellChat分析了CCL趋化因子家族。该分析表明，在AAA样本中，巨噬细胞与多种免疫细胞类型（特别是T细胞、B细胞和NKT细胞）之间富含CCL相关的通讯模式。推断的CCL20-CCR6相关通讯在AAA组织中主要在巨噬细胞与T细胞、B细胞和NKT细胞之间观察到。与人组织的免疫荧光分析一致，显示组间巨噬细胞丰度无显著差异，但AAA组织中适应性免疫细胞（包括T细胞和B细胞）的浸润增加。这些观察结果，连同推断的通讯模式，表明巨噬细胞源性的CCL20-CCR6信号在AAA病变内的免疫细胞招募中具有潜在作用。为了功能验证这一假设，研究进行了Transwell共培养实验，使用脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞和T细胞或B细胞，并在存在CCL20中和抗体的情况下进行。流式细胞术分析显示，阻断CCL20-CCR6轴显著减少了T细胞和B细胞的迁移。这些功能数据共同支持了巨噬细胞源性CCL20-CCR6信号在促进免疫细胞迁移中的作用，为CellChat分析提示的通讯模式提供了实验验证。
3.6 靶向CCL20-CCR6轴抑制AAA进展
为了验证CCL20-CCR6轴在AAA发展中的作用，研究通过输注血管紧张素II（Ang II）在ApoE-/-小鼠中建立了AAA模型。通过尾静脉注射AAV-shCCL20或AAV-shCCR6进行干预。实时定量PCR验证了主动脉组织中CCL20和CCR6的敲低效率。与对照组相比，AAA组中CCL20和CCR6的表达水平均显著更高。敲低CCL20或CCR6显著降低了AAA的发病率。这些发现进一步得到血管多普勒超声成像和最大主动脉外径测量的证实。形态学和组学分析表明，破坏CCL20-CCR6轴减轻了主动脉壁的炎症、弹力蛋白降解和胶原沉积。此外，免疫荧光和免疫组化染色显示，AAA组织中CCR6表达升高，同时伴有大量的T细胞和B细胞浸润。相比之下，敲低CCL20或CCR6减少了这些免疫细胞的积聚。通过多重免疫荧光，使用F4/80+CD86+iNOS+作为代表性M1样标志物，F4/80+CD206+Arg1+作为代表性M2样标志物，进一步验证了巨噬细胞极化状态。实验结果表明，阻断CCL20-CCR6轴减弱了促炎M1极化倾向，增强了抗炎M2极化倾向。总之，这些结果表明靶向CCL20-CCR6轴可减少T细胞和B细胞浸润，并抑制AAA进展。
4 讨论
本研究采用整合的单细胞和批量RNA测序，以及实验和外部数据验证，阐明了AAA发病机制的细胞和分子基础。分析揭示了AAA组织中深刻的免疫细胞浸润（特别是T细胞和B细胞）和结构性细胞耗竭（成纤维细胞、内皮细胞和SMCs），这是由偏向促炎M1样巨噬细胞的巨噬细胞极化失衡驱动的。这种失衡促进了CCL20的分泌，从而将表达CCR6的免疫细胞（CCR6+T细胞和CCR6+B细胞）招募到动脉瘤组织中。ELISA和免疫荧光分析证实了AAA患者血清和组织样本中CCL20水平显著升高。通过在AAA中使用CCL20-CCR6轴的敲低模型和CCL20介导的巨噬细胞趋化性的体外中和模型，评估了该轴对AAA的影响。研究结果强调了CCL20-CCR6轴是AAA发病机制的关键调节因子和潜在治疗靶点。
巨噬细胞浸润和极化在整个动脉瘤发展过程中演变。M1/M2样巨噬细胞特征代表了简化的极化轴，并未涵盖巨噬细胞异质性的全部谱系；因此，这些结果应被解释为功能倾向而非离散的巨噬细胞亚型。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路在AAA巨噬细胞中高度激活。巨噬细胞极化是AAA的关键驱动因素。促炎M1巨噬细胞通过加剧炎症和分泌细胞因子加速AAA。本研究中，M1样巨噬细胞极化在AAA巨噬细胞中表现明显，存在偏向M1样而非M2样的失衡。IL-1α、CXCL10和CCL20成为分泌最多的三种趋化因子，其中IL-1α和CXCL10先前已被证实与AAA发病机制相关。本研究聚焦于第三种关键趋化因子CCL20及其独家受体CCR6，以阐明它们在塑造AAA免疫微环境和驱动AAA进展中的具体作用。CCL20-CCR6轴在心血管疾病中调节免疫反应，但其在AAA中的作用仍未充分探索。观察到M1样巨噬细胞极化显著增加了AAA血清和组织中的CCL20表达。与先前研究一致，基于本研究和UK Biobank数据，CCL20可作为大型队列中AAA的潜在生物标志物。
免疫细胞浸润长期以来被认为是AAA慢性炎症进展的基本机制，其中趋化因子起着关键作用。与先前发现一致，单细胞分析揭示了AAA组织中深刻的细胞失衡，其特征是广泛的免疫细胞浸润（T细胞和B细胞）和结构性细胞（成纤维细胞、内皮细胞和SMCs）的丢失。Ro/e分析进一步证明免疫细胞（T细胞和B细胞）对AAA组织表现出显著的组织偏好性，表明与动脉瘤进展风险有强关联。CellChat分析表明，在AAA组中，巨噬细胞在与T细胞、B细胞和NKT细胞的通讯中尤为突出。基于CellChat的通讯分析是推断性和假设生成性的，未来需要供体感知建模和功能验证来进一步定义这些信号通路的生物学相关性。
研究提出，活跃的CCL20-CCR6轴为解释CCR6表达免疫细胞（CCR6+T细胞和CCR6+B细胞）的特异性招募及随后的炎症级联反应提供了机制框架。T细胞是AAA中的主要免疫细胞群，它们可以促进AAA形成，并在AAA模型中刺激巨噬细胞产生促炎介质如IL-17和TNF-α。IL-17可以刺激SMCs和成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶和包括CCL20在内的促炎细胞因子，从而建立一个正反馈回路，维持持续的淋巴细胞招募。此外，来自其他T细胞亚群的细胞因子，如Th1细胞的IFN-γ，可以协调细胞外基质重塑。同时，浸润的B细胞通过分泌免疫球蛋白（如IgA和IgG）和细胞因子如IL-6和TNF-α来影响AAA进展，这些物质降解主动脉壁并加剧炎症反应。清除B细胞可以保护小鼠免受实验性AAA的影响，并促进免疫抑制的主动脉环境。CCL20-CCR6轴将巨噬细胞激活与CCR6+T细胞和CCR6+B细胞的靶向招募联系起来。这些效应细胞的分泌产物反过来作用于血管壁细胞和免疫细胞，加重炎症反应并加速动脉瘤进展。
抑制趋化因子轴在AAA动物模型中已被证明有效，例如CCL5-CCR5或CCL2-CCR2通路。CCL20-CCR6轴在调节AAA慢性炎症期间的免疫反应中至关重要，强调了开发靶向该轴的治疗策略的必要性。过表达的CCL20促进主动脉弹力蛋白降解，抑制M2极化，并加速AAA，表明其加剧炎症并驱动进展。在动脉粥样硬化中，CCR6的缺失有效改善了炎症进展和斑块大小。然而，靶向CCL20-CCR6在AAA中的机制和疗效尚不清楚。本研究提供了初步证据，表明在该AAA模型中阻断该轴可降低主动脉直径、动脉瘤发病率和免疫细胞浸润。与先前研究一致，AAA模型成功再现了人AAA的关键病理特征，包括慢性炎症和巨噬细胞主导的免疫浸润。
本研究整合生物信息学分析与实验验证，探索AAA发病机制的细胞和分子机制。分析揭示了CCL20分泌的关键作用，其由M1样巨噬细胞极化失衡驱动，招募CCR6+免疫细胞（如CCR6+T细胞和CCR6+B细胞）促进AAA发展。实验框架已经整合了两个层次的证据：1）体内遗传证据（AAV-shCCL20敲低）证明了CCL20在复杂组织微环境中疾病进展的必要性；2）体外药理学
