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本研究针对蜱传环状病毒（Orbivirus）中的Tribe?病毒（TRBV）遗传多样性与进化机制开展调查。研究人员通过新设计的RT-PCR方法在斯洛伐克地区山羊携带的篦子硬蜱（Ixodes ricinus）中检测并分离到一株新病毒株，利用免疫荧光、病毒复制动力学及全基因组测序等技术进行鉴定和系统发育分析。研究首次发现该毒株存在基因组重配（reassortment）事件，其编码NS1蛋白的第4基因组片段可能源自1960年代的原型毒株。这一结果为理解蜱传环状病毒的传播、生态学及潜在的致病机制提供了重要依据，并强调了对神经系统感染进行更广泛鉴别诊断的必要性。
在欧洲和亚洲的森林与草地中，篦子硬蜱（Ixodes ricinus）等蜱类不仅是蜱传脑炎病毒（TBEV）的传播者，还携带着一群不那么引人注目但同样具有潜在威胁的病原体——蜱传环状病毒（tick-borne orbiviruses）。其中，Tribe?病毒（TRBV）、Kemerovo病毒（KEMV）、Lipovník病毒（LIPV）和日本的Muko病毒（MUKV）都属于大岛病毒（Great Island virus, GIV）血清群。这些病毒与TBEV共享相似的生态位和传播循环。已有报告将KEMV、LIPV和TRBV的感染与不明病因的神经系统疾病病例联系起来，感染症状可能与蜱传脑炎相似。然而，由于缺乏特异性的临床症状，加之诊断上的挑战，这些病毒在中枢神经系统（CNS）感染的鉴别诊断中常常被忽视。例如，在斯洛伐克，2016年至2018年间，有40%的病毒性中枢神经系统感染被诊断为“非特异性病毒性脑炎、脑膜炎或病毒性中枢神经系统感染”，这凸显了对这些“被遗忘”的病毒加强监测和理解其进化动力学的迫切需求。为了更深入地了解TRBV的遗传多样性、潜在的进化机制及其在自然界中的循环，研究人员在斯洛伐克开展了一项研究。
本研究主要应用了以下几个关键技术方法：首先，研究人员从斯洛伐克杜布拉瓦地区放牧的山羊身上收集了篦子硬蜱，并采集了山羊血清样本。其次，研究团队为新检测目的设计了一对特异性引物，采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对蜱样本进行病毒筛查。第三，利用Vero E6细胞对RT-PCR阳性的蜱悬液进行病毒分离，并通过免疫荧光技术（immunofluorescence）和中和试验（neutralization test）分别进行病毒抗原鉴定和山羊血清抗体检测。第四，研究了新分离毒株在啮齿动物（BHK-21）、人（HFF-1）和牛（BT）细胞系中的复制动力学。最后，通过下一代测序（next-generation sequencing）获取了病毒的全基因组序列，并利用系统发育分析（phylogenetic analysis）和重组检测程序（Recombination Detection Program 4， RDP4）等生物信息学工具进行遗传特征和重配分析。
Detection and isolation of TRBV in ticks（TRBV的检测与分离）
研究团队新设计了一对针对GIV血清群病毒第1基因组片段的引物，其RT-PCR检测限为103PFU/ml。从一只饱血雌性篦子硬蜱的匀浆中检测到病毒RNA，并通过测序证实其为TRBV。将该匀浆接种Vero E6细胞后，成功分离到一株新的TRBV毒株，命名为16.C/2016/Dubrava/SVK。
Prevalence of TRBV neutralization antibodies in grazing goats（放牧山羊中TRBV中和抗体的流行率）
对同一地区放牧山羊的血清学监测显示，所有动物在研究期间均保持临床健康。2016年未检测到中和抗体，2017年9只山羊中有5只（55.6%）出现低滴度（1:10至1:20）的血清阳转，表明它们在该地区感染了TRBV或相关病毒。
The replication of TRBV isolate in rodent, human and bovine cell lines（TRBV分离株在啮齿类、人和牛细胞系中的复制）
病毒复制动力学研究表明，新毒株在三种细胞系中均能复制并引起细胞病变效应（CPE），但效率不同。在啮齿类BHK-21细胞中复制效率最高，病毒滴度持续上升至72小时，达到5.75 × 105PFU/ml。而在人源HFF-1和牛源BT细胞中，病毒复制受到一定限制，峰值滴度分别为6.83 × 103PFU/ml和5.00 × 104PFU/ml，这可能与这些细胞完整的I型干扰素应答有关。
Genetic and phylogenetic analysis（遗传与系统发育分析）
对新毒株进行全基因组测序和比对分析发现，其大多数基因组片段与其他TRBV毒株以及日本的MUKV毒株具有较高的序列一致性。然而，编码外衣壳蛋白VP4（OC1）的第5片段是一个例外，它与俄罗斯的KEMV毒株在序列一致性和系统发育关系上更为接近。此外，编码NS3糖蛋白的第10片段显示出最高的遗传变异性：斯洛伐克和罗马尼亚的TRBV毒株与MUKV聚为一支，而乌克兰的TRBV毒株则与KEMV形成姊妹支。
Reassortment analysis（重配分析）
利用RDP4软件对串联的TRBV基因组序列进行分析，预测到一个重配事件。该事件得到六种检测方法的支持，预测的重组断点位于串联序列的第8191和10049位点，对应于第4基因组片段。SimPlot分析进一步支持了这一发现。这表明新分离株16.C/2016/Dubrava/SVK的第4片段（编码NS1蛋白）可能源自20世纪60年代在斯洛伐克分离的原型TRBV毒株。
本研究总结与讨论部分强调了蜱传环状病毒在诊断和公共卫生方面的重要性。研究成功从斯洛伐克地区的蜱体内分离并鉴定了新的TRBV毒株，证实了该病毒在当地自然疫源地中的持续循环。血清学证据表明，放牧山羊可以成为监测蜱传病毒暴露的有用哨兵动物。
遗传分析揭示了TRBV复杂的进化图景。虽然TRBV、MUKV、LIPV和KEMV目前被归类为同一病毒物种（GIV）的不同血清型，但本研究和先前工作表明，它们在关键的RdRp和T2蛋白上的序列一致性低于物种划分的典型阈值，提示它们可能代表地理分布广泛的、不同的环状病毒谱系。特别值得关注的是，新毒株的外衣壳蛋白VP4（OC1）在系统发育上与KEMV聚在一起，而其他内部蛋白则与TRBV/MUKV分支更近，这种“镶嵌式”的基因组构成是病毒进化中重配事件的典型特征。研究明确鉴定出新毒株的第4片段（编码NS1蛋白）可能源自历史毒株，这是首次在TRBV中报道自然发生的重配事件。NS1蛋白是病毒蛋白合成的正调节因子，其重配可能影响病毒在宿主或媒介中的适应性和复制效率，这在对蓝舌病病毒（bluetongue virus, BTV）的研究中已有先例。
此外，研究观察到第10片段（编码NS3/NS5蛋白）的高变异性，这可能影响病毒在细胞内的运输和释放机制，进而影响其在不同媒介或宿主中的传播效率。
在讨论中，作者指出，尽管蜱传环状病毒在IFN-Ⅰ型反应完备的细胞中复制受限，但它们仍能成功复制，提示其可能存在如NS4蛋白介导的免疫逃逸机制，这一点值得未来研究。最后，作者呼吁有必要开展进一步研究，以阐明这些病毒的生态学、宿主免疫反应及其抗病毒逃避机制，特别是考虑到它们与不明病因的神经系统疾病的潜在关联，以及在全球气候变化和人类活动影响下蜱媒疾病负担可能增加的趋势。
本研究发表在《Archives of Virology》上，为理解蜱传环状病毒的遗传多样性、进化动力学及其在自然界的维持机制提供了新的重要数据，强调了在病毒性中枢神经系统感染鉴别诊断中考虑这些病原体的必要性，并为未来的监测和防控策略提供了科学依据。
