《Frontiers in Microbiology》：Bactericidal and antibiofilm activity of lactic acid bacteria-derived cell free extracts against dairy-associated spoilage and pathogenic bacteria
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本研究系统评估了15株乳酸菌（LAB）通过五种提取物（CFS、IC、ICS及其中和变体）的抗菌与抗生物膜潜力。采用琼脂扩散、生长抑制、生物膜抑制、最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）测定等方法，结合高效液相色谱（HPLC）、细胞泄漏、杀菌动力学（Time-kill）及扫描电子显微镜（SEM）分析，筛选出对乳品相关病原体与腐败菌具有最强拮抗活性的菌株-提取物组合，揭示了有机酸在抑菌中的核心作用，为开发用于乳品系统的天然生物防控剂提供了科学依据。
引言：挑战与机遇
微生物污染一直是奶酪等乳制品生产中的主要挑战之一，食源性病原体（如沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌）和腐败微生物（特别是假单胞菌属和肠杆菌科细菌）可严重影响产品质量、缩短货架期并威胁消费者健康。这些污染与生产、处理或储存过程中的诸多环节有关，包括挤奶卫生不佳、设备清洁消毒不彻底导致生物膜形成、冷链温度控制不当、巴氏杀菌后的二次污染以及环境卫生管理不善等。这些挑战凸显了对有效、天然的乳品微生物控制策略的需求。
在此背景下，乳酸菌在食品发酵中扮演着核心角色，其产生的有机酸、细菌素等抗菌代谢物能够抑制有害微生物。近年来，研究的兴趣已扩展到使用乳酸菌来源的提取物，这类提取物包含从灭活细胞和培养上清液中获得的生物活性化合物。与依赖活微生物的益生菌或生物防腐剂培养物不同，乳酸菌提取物仅通过代谢产物发挥作用，使其在清洁标签食品应用中更具吸引力。这些提取物包括无细胞上清液、富含胞外代谢物的培养基以及细胞灭活后释放的胞内成分，代表了一组多样化的生物活性微生物产品。尽管物理、化学和生物处理方法的联合应用通常能增强微生物灭活效果，但单个乳酸菌提取物中多种代谢物的协同作用也可能增强其抗菌效力。乳酸菌来源的化合物已在食品系统中显示出对抗生物膜形成和微生物污染的良好活性，这顺应了市场对天然、最小加工产品的需求增长。
然而，对多种乳酸菌菌株及其衍生物提取物（特别是在食源性病原体和乳制品相关腐败菌背景下）的比较性评价仍然有限。此外，不同提取物制备物中，有机酸、细胞相关成分及其他代谢物对抗菌活性的相对贡献尚未被完全阐明。评估仅含上清液、仅含灭活细胞或两者组合（包括原生和中和版本）的提取物，有助于阐明微生物抑制的潜在机制，并支持其在乳品系统中的合理应用。
材料与方法：系统筛选与评价
本研究旨在对15株乳酸菌（LAB）进行抗菌和抗生物膜活性的比较筛选，以针对乳品相关的腐败和病原微生物。系统地评估了五种类型的乳酸菌提取物（无细胞上清液CFS、灭活细胞IC、两者组合ICS，以及它们的中和变体CFS N和ICS N），以确定有机酸和细胞相关成分对微生物抑制的贡献。这种方法能够识别和选择出最有效的菌株-提取物组合，为乳品系统开发天然生物防控剂奠定基础。
研究中使用了15株乳酸菌和7株致病及腐败微生物。通过琼脂扩散法初步筛选抗菌活性。随后，利用微孔板法测定提取物的拮抗和抗生物膜活性，并计算抑制百分比。通过Z-score分析对抗菌和抗生物膜结果进行标准化，以识别性能一致的提取物。进一步测定了最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。对活性提取物，采用高效液相色谱（HPLC）分析有机酸谱，通过细胞泄漏实验检测核酸释放，使用时间-杀菌动力学（Time-kill）实验评估杀菌速率，并利用扫描电子显微镜（SEM）观察细菌细胞形态变化。所有实验均进行统计学分析。
结果：活性、机制与成分
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抗菌与抗生物膜效应
琼脂扩散实验表明，单核细胞增生李斯特菌ATCC 19117和荧光假单胞菌07A显示出最大的抑菌圈，但抑制模式因菌株而异。生长抑制和抗生物膜实验进一步证实了乳酸菌提取物的潜力。pH测定显示，CFS和ICS呈酸性（pH 3.84-4.61），而其中和变体接近中性。Z-score分析鉴定出植物乳杆菌Q4C3、乳酸乳球菌亚种ATCC 13675、ATCC 19435、Lc08和食窦魏斯氏菌W21是在各实验中表现出最一致抑制性能的菌株。热图分析表明，CFS和ICS是总体上最有效的提取物类型。
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最低抑菌浓度与杀菌浓度
CFS和ICS表现出最低的MIC值，具体取决于菌株和目标物种。来自植物乳杆菌Q4C3、乳酸乳球菌Lc08和食窦魏斯氏菌W21的提取物最常观察到较低的MIC值。相比之下，中和后的提取物对大多数目标微生物显示出减弱或无抑制活性。在评估的提取物中，只有CFS和ICS显示出杀菌活性，因此被选择用于后续的细胞泄漏、时间-杀菌和SEM分析。
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细胞泄漏
细胞泄漏分析显示，在所有评估的菌株中，CFS处理比ICS处理导致更高的胞外核酸水平。其中，来自乳酸乳球菌生物变型丁二酮乳亚种SBR4、植物乳杆菌Q4C3、食窦魏斯氏菌W21和绿色魏斯氏菌W23的提取物产生了最高的泄漏值。
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时间-杀菌动力学
以荧光假单胞菌07A和单核细胞增生李斯特菌ATCC 19117为代表菌株进行时间-杀菌评估。CFS处理在4小时内导致菌落数降低超过3个对数值（log10CFU/mL），而ICS处理在同一时间内产生约2个对数值的降低。对于CFS，6小时后未检测到活细胞。对于ICS，4小时后检测到存活的荧光假单胞菌细胞，但在6小时后显著减少。因此，选择4小时作为后续实验中ICS和CFS处理的接触时间。
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有机酸定量分析
检测到的有机酸包括乳酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。与CFS相比，ICS中所有菌株的有机酸浓度均较低。有机酸的种类和浓度在不同提取物间差异显著。
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扫描电镜观察
SEM图像揭示了细菌细胞在暴露于乳酸菌提取物后的结构改变。对于荧光假单胞菌07A，经CFS处理的细胞比ICS处理的细胞表现出更广泛的变形。单核细胞增生李斯特菌也观察到类似模式。两种菌的对照细胞均保持完整形态，而处理过的细胞则表现出不同程度的表面不规则，包括凹陷和扭曲。与ICS相比，CFS处理的细胞形态变化始终更明显。
讨论：机制、菌株差异与应用潜力
本研究中，乳酸菌提取物对乳品系统中相关的食源性病原体和腐败微生物表现出显著的抗菌和抗生物膜活性，但其抑制强度和范围具有明显的菌株依赖性。一个贯穿各实验的一致发现是，非中和提取物（CFS和ICS）在MIC值和抗生物膜活性方面均优于其中和版本（CFS-N和ICS-N）。这种模式支持了有机酸在乳酸菌提取物抗菌作用中的核心作用。中和后活性的部分或完全丧失，强化了这一解释，并与之前关于非中和植物乳杆菌上清液具有强抗菌活性、中和后消失的报道一致。
所获有机酸谱有助于解释观察结果。乳酸、乙酸和丙酸检测浓度最高，甲酸、柠檬酸、琥珀酸、丁酸和戊酸也有贡献。从CFS到ICS的转变伴随着有机酸浓度的普遍降低和pH值的轻微上升，表明由于细胞裂解后胞内液的释放导致了酸的部分中和。弱酸在低pH下显示出更强的抗菌活性，乙酸和丙酸通常比乳酸具有更强的抑制作用，因为其较高的pKa值有利于在酸性环境中形成更高比例的非解离分子。在混合酸体系中，乳酸主要有助于降低pH，而乙酸和丙酸则作为主要的抗菌成分，通常表现出协同效应。因此，CFS和ICS中有机酸的组成和浓度强烈影响观察到的抑制谱。
尽管pH中和实验为酸介导的抗菌机制提供了有价值的见解，但它们并不排除pH敏感的细菌素或其他代谢物的贡献。乳酸菌产生的几种抗菌肽已知在酸性条件下更具活性和稳定性，而在中性或碱性pH下，由于电离状态变化和部分肽变性，活性降低或结构不稳定。因此，中和后观察到的抗菌效力降低，可能不仅反映了有机酸活性的丧失，也反映了细菌素和其他酸依赖性代谢物功能的减弱。
与这一解释一致，在某些中和提取物中检测到的残留抗菌活性表明存在额外的、酸非依赖性代谢物的贡献。例如，乳酸乳球菌Lc08在中和后保留了抗菌活性，这与之前描述其产生在宽pH范围内稳定、仅在高压灭菌后才失活的拮抗化合物的报告一致。同样，被鉴定为尼生素Z产生菌的乳酸乳球菌生物变型丁二酮乳亚种SBR4，其中和后的行为与其已知特性一致。总之，这些结果支持一个模型，即有机酸提供基础的抗菌效应，而细菌素可进一步增强此效应。
魏斯氏菌属菌株也成为了乳品环境中生物防治的有前景候选者。本研究表明，食窦魏斯氏菌W21、W22和绿色魏斯氏菌W23结合了相关的抗菌和抗生物膜活性。一些魏斯氏菌源提取物在中和后仍保留部分活性，表明其产生了除有机酸外的其他生物活性代谢物，加强了该属作为细菌素和提取物制备来源的潜力。
尽管魏斯氏菌菌株已显示出相关的抗菌和抗生物膜潜力，但其作为活菌培养物的应用需谨慎对待。该菌株尚未完全建立安全性。这种监管限制凸显了在工业应用前进行菌株特异性安全性评估的必要性。在此背景下，应用源自魏斯氏菌的无细胞提取物代表了一种更安全的替代方案，允许利用有机酸和细菌素等生物活性代谢物，而无需承担施用活微生物的相关风险。
除了安全性考虑，生物防治策略的另一层复杂性在于，对浮游细胞的抗菌效力并不一定能有效转化为生物膜抑制。这种差异表明，生物膜抑制不能仅仅归因于活细胞数量的减少。乳酸菌衍生的代谢物，如过氧化氢、含氧化合物、胞外多糖、细菌素和具有表面活性的脂肪酸，已被确定为关键的抗生物膜剂。在本研究中，乳酸菌提取物对腐败和病原微生物表现出菌株依赖性的抗菌和抗生物膜活性，突出了拮抗机制的多样性。Z-score排名和生长/生物膜抑制数据证实，只有一部分乳酸菌菌株在两种表型上都能持续表现出高性能，这强调了在设计生物防治策略时需要进行菌株水平筛选的重要性。
在此背景下，乳酸菌提取物的物理组成，特别是ICS中细胞碎片的存在，成为影响抗菌和抗生物膜性能的关键因素。一些处理中细胞碎片的存在与抗菌潜力的降低有关，特别是对于ICS。一种可能的解释是，细胞残留物、胞外聚合物、蛋白质、脂质和核酸可能在靶细胞周围形成物理屏障，部分屏蔽了可扩散的抗菌代谢物。相反，其他研究表明，灭活的乳酸菌细胞可以通过在表面形成物理层来减少病原体的粘附，从而限制其定植。这些看似矛盾的观点突显了细胞碎片的作用是依赖于具体情境的，并受到基质组成、微生物种类以及可扩散成分与细胞相关成分相对贡献等因素的影响。在我们的实验条件下，过滤和去除细胞残留物提高了抗菌性能，这与观察到的CFS比ICS活性更高一致。在实际应用中，乳酸菌提取物在真实食品系统中的行为受到周围基质的影响。有机质可以调节酸的效力，根据酸的种类和食品环境，某些成分会降低，而另一些则会增强抗菌效果。
除了基质相关效应，靶微生物之间固有的结构差异也影响了乳酸菌提取物的效力。一个值得注意的结果是CFS能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。虽然细菌素通常对革兰氏阳性菌更有效，但CFS中有机酸和其他代谢物的组合可能会通过增加膜通透性来破坏革兰氏阴性菌的外膜屏障。先前的研究表明，乳酸菌的有机酸和CFS可以诱导K+离子、核酸和蛋白质的泄漏，反映了对细胞质膜的直接损伤。MIC和时间-杀菌数据，连同泄漏实验，支持一种机制，即酸和相关代谢物促进生物活性化合物接近细胞膜，从而将抑制谱扩大到包括假单胞菌属等革兰氏阴性腐败菌。
细胞泄漏和SEM分析为乳酸菌提取物的作用模式提供了进一步的见解。CFS处理始终比ICS导致更高的胞外核酸水平，SEM图像显示暴露于CFS的荧光假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌细胞发生显著的形态改变，包括表面塌陷、皱缩和结构扭曲。这些发现与之前报道乳酸菌CFS处理导致细菌膜损伤、细胞肿胀、液泡形成和胞内成分泄漏的研究一致。综合来看，这些观察结果支持了乳酸菌衍生代谢物与膜磷脂和蛋白质相互作用、改变膜流动性、促进孔道形成并最终导致泄漏和细胞死亡的观点。
时间-杀菌实验揭示的快速杀菌动力学，进一步反映了通过SEM和核酸释放实验观察到的膜损伤和泄漏效应。时间-杀菌实验不仅突出了提取物的杀菌能力，也凸显了其作用速度。对于单核细胞增生李斯特菌，CFS导致了活菌计数的快速下降，而荧光假单胞菌需要稍长的暴露时间才能达到类似效果。ICS在两种情况下都比CFS需要更长的接触时间。与之前需要更长时间暴露或更高倍MIC才能实现有限对数值降低的研究相比，本文评估的提取物显示出更快、更显著的杀菌活性。这种增强的效力可能反映了有利的有机酸谱和额外的可扩散代谢物的综合效应，正如MIC/MBC结果以及泄漏和SEM数据所提示的那样。
结论
本研究证明，乳酸菌提取物，特别是来自植物乳杆菌Q4C3、乳酸乳球菌生物变型丁二酮乳亚种SBR4、食窦魏斯氏菌W21和绿色魏斯氏菌W23的CFS，兼具快速杀菌活性、抗生物膜效应以及对乳品相关污染物的广谱抑制作用。通过系统比较多种乳酸菌菌株和提取物类型，本研究确定了最具工业应用潜力的菌株和提取物组合。这些发现支持使用这些提取物作为天然、快速起效的生物防治剂，以提高乳制品的微生物安全性和质量，同时也为未来在真实食品基质和试点规模应用的研究提供了框架。
