《Frontiers in Plant Science》：Integrated genomic and transcriptomic analysis of maize SRC2-like genes highlights divergent roles in abiotic stress responses
编辑推荐：
本研究通过对玉米SRC2-like基因家族进行整合基因组学与转录组学分析，系统鉴定了15个ZmSRC2L家族成员，解析了其分子特性、进化关系、启动子调控网络、亚细胞定位及在干旱、热、冷等非生物胁迫下的表达模式。研究亮点在于利用Ds插入突变体进行功能验证，首次明确了ZmSRC2L2是调控玉米干旱耐受性的关键基因，为玉米抗逆性改良提供了新的分子靶点。
1. 玉米SRC2-like基因家族的鉴定与表征
本研究在全基因组水平上对玉米中的SRC2-like基因家族进行了系统性鉴定。研究人员利用拟南芥AtSRC2的氨基酸序列作为查询序列，通过BLASTP搜索玉米蛋白质组，并结合Pfam和NCBI保守结构域数据库确认了C2_SRC2_like结构域的存在。最终，在玉米中共鉴定出15个SRC2-like基因，根据其在染色体上的物理位置，将其命名为ZmSRC2L1至ZmSRC2L15。这些基因在1至8号染色体上呈不均匀分布，其中3号染色体上成员最多，有4个基因，而9号和10号染色体上未发现该家族成员。编码序列长度在312至1，170 bp之间，编码212至402个氨基酸，预测的蛋白质分子量范围约为21.93至42.52 kDa。所有ZmSRC2L蛋白均为亲水性蛋白，其理论等电点变化范围较大，从酸性（4.67）到碱性（10.04）不等。基因结构分析显示，除了ZmSRC2L6和ZmSRC2L8含有内含子外，其余13个基因均不含内含子，表明其基因结构相对紧凑。通过MEME套件进行基序分析，在所有蛋白中鉴定出3个保守基序，其中基序1和3存在于所有成员中，而基序2在ZmSRC2L9和ZmSRC2L10中缺失，这暗示了基因复制后的功能分化。系统进化分析将15个ZmSRC2L蛋白分为四个亚家族，揭示了该家族内部的进化关系。
2. 禾本科植物中SRC2L基因的系统进化、共线性与选择压力分析
为了探究SRC2L基因家族在禾本科中的进化关系，研究人员构建了包含玉米、水稻、高粱、谷子和青狗尾草五个物种SRC2L蛋白序列的系统发育树。结果显示，所有SRC2L蛋白被分为四个主要分支，表明在这些禾本科物种分化之前，该基因家族可能经历了古老的复制和分化事件。值得注意的是，玉米的SRC2L基因分布于所有四个分支中，而水稻和高粱的成员数量相对较少，暗示了谱系特异性的基因丢失或收缩。共线性分析揭示了玉米与其他四个物种（特别是谷子和青狗尾草）之间存在广泛的同源基因对，反映了禾本科基因组间的高度保守性。通过计算同源基因对的非同义替换率、同义替换率及其比值，研究人员评估了作用于该基因家族的选择压力。结果显示，绝大多数基因对的比值小于1，表明SRC2L基因在进化过程中主要受到纯化选择，以维持其保守的生物学功能。然而，也有少数同源基因对表现出相对较高的比值，提示在某些SRC2L成员（尤其是玉米谱系中）可能存在由正选择驱动的功能分化。
3. ZmSRC2L基因的启动子顺式作用元件分析与转录因子预测
对15个ZmSRC2L基因起始密码子上游2 kb启动子区域的顺式作用元件进行分析，揭示了该基因家族在调控上的功能多样性。启动子中含有丰富的与光响应、激素响应和胁迫响应相关的顺式作用元件。光响应元件在大多数启动子中含量丰富。激素响应元件，如响应脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素的ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif和P-box，在多个启动子中富集，尤其是在ZmSRC2L2、ZmSRC2L7、ZmSRC2L8、ZmSRC2L14和ZmSRC2L15中，表明这些基因可能参与激素信号通路。此外，胁迫相关元件也在ZmSRC2L2、ZmSRC2L8、ZmSRC2L14和ZmSRC2L15中显著富集，提示它们可能通过植物激素信号通路介导对环境胁迫的响应。利用植物转录因子数据库预测了可能调控ZmSRC2L基因的转录因子，共鉴定出16个转录因子家族。其中，ERF家族成员最多，有12个，主要预测调控ZmSRC2L1、ZmSRC2L4、ZmSRC2L8和ZmSRC2L15。6个MYB家族转录因子与调控ZmSRC2L4、ZmSRC2L9、ZmSRC2L13和ZmSRC2L15相关。此外，MADS家族转录因子与大多数ZmSRC2L基因的调控相关。在这些基因中，ZmSRC2L15被预测受最多的转录因子调控，其中ERF家族占主导。这些分析为深入研究ZmSRC2L基因在植物生长发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。
4. ZmSRC2L蛋白的亚细胞定位
为了研究ZmSRC2L蛋白的亚细胞定位，研究人员将每个基因的编码序列与绿色荧光蛋白融合，构建了瞬时表达载体，并在玉米原生质体中进行了亚细胞定位分析。结果显示，大多数GFP-ZmSRC2L融合蛋白主要定位于质膜。这种定位模式与C2结构域的生化特性一致，该结构域通常介导钙离子依赖的磷脂结合和膜关联，使得C2结构域蛋白能够作为膜相关信号转导的分子传感器和介质。因此，定位于质膜的ZmSRC2L蛋白可能在钙离子依赖性信号传导或膜界面的胁迫感知中发挥作用。此外，ZmSRC2L2、ZmSRC2L6和ZmSRC2L15表现出在质膜和细胞核的双重定位，这表明这些蛋白可能介导早期膜来源的钙离子信号与下游转录响应之间的串扰。这些多样的亚细胞定位模式反映了ZmSRC2L蛋白的功能特化，使玉米能够协调不同的信号通路以响应环境胁迫。
5. ZmSRC2L基因的组织特异性表达与非生物胁迫响应模式
通过RT-qPCR分析ZmSRC2L基因在玉米不同组织中的表达模式，结果显示该家族成员具有明显的组织特异性。例如，ZmSRC2L1、ZmSRC2L4、ZmSRC2L5、ZmSRC2L7和ZmSRC2L15在穗中优先表达；ZmSRC2L10、ZmSRC2L11和ZmSRC2L14在叶片中高表达；而ZmSRC2L2和ZmSRC2L6则在节间和根中表达占优势。这些独特的组织特异性表达谱表明，ZmSRC2L基因可能在玉米生长发育中扮演多样化且专门化的角色。为了阐明ZmSRC2L基因在非生物胁迫响应中的潜在作用，研究人员对遭受干旱、热和冷胁迫的玉米幼苗叶片和根部组织进行了转录组测序。结果显示，在相同胁迫条件下的样本聚集在一起，证实了转录组数据的可靠性。其中，属于第III组的基因在玉米中表达相对较高，而属于I、II和IV组的基因表达较低。值得注意的是，ZmSRC2L7和ZmSRC2L8以及ZmSRC2L4在所有成员中表达量最低。进一步分析基因在不同胁迫时间点的差异表达变化，揭示了ZmSRC2L基因在非生物胁迫下多样的表达模式。在轻度干旱下，这些基因的表达没有显著变化，而在严重干旱胁迫下，所有基因均显著下调。在热胁迫下，ZmSRC2L10和ZmSRC2L11在叶和根中均显著下调，而ZmSRC2L1和ZmSRC2L3在叶片中显著上调。有趣的是，ZmSRC2L5和ZmSRC2L14在热胁迫早期和冷胁迫后期在叶片中被强烈诱导。值得注意的是，ZmSRC2L7虽然基础表达水平低，但其在根中的表达在干旱、热和冷胁迫下被显著诱导或抑制。这些组织特异性和胁迫特异性的表达谱表明，不同的ZmSRC2L成员在玉米生长发育和环境适应中扮演着不同的角色。
6. ZmSRC2L2功能缺失增加玉米对干旱的敏感性
为了探究ZmSRC2L基因家族在非生物胁迫响应中的作用，研究人员筛选了Ds转座子插入突变体库，并鉴定出一个ZmSRC2L2的Ds插入突变体。序列分析显示，一个约2 kb的Ds元件插入到翻译起始位点下游692 bp的编码区，导致其功能丧失。在幼苗期进行的干旱、热和冷胁迫条件下的表型分析显示，zmsrc2l2突变体特异性地对干旱胁迫表现出增强的敏感性。在干旱条件下，突变体叶片的相对含水量显著低于野生型。同样，与野生型相比，突变体在干旱胁迫下的过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，以及脯氨酸和可溶性蛋白的积累量均显著降低。相比之下，在热或冷胁迫下，突变体与野生型在整体表型、相对含水量、抗氧化酶活性或渗透调节物质方面未观察到显著差异。这些结果表明，ZmSRC2L2在赋予玉米耐旱性方面起着关键作用，但在介导对温度胁迫的响应中不起作用，这为该基因家族内部的功能分化和胁迫响应特异性提供了遗传学证据。
