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本篇研究开发了一种成像波长延伸至1700纳米的近红外二区(NIR-II)显微内窥镜，首次实现了对活体哺乳动物深部肠道（超越粘膜层）及穿直肠壁的非侵入性、亚10微米分辨率成像。该系统凭借特制的大视场，成功对完整腰淋巴结进行了无创经直肠成像，揭示了荷瘤小鼠的异常淋巴引流，并在健康与结肠炎小鼠模型中实现了直肠血管网络和腰淋巴结的纵向在体成像，为研究肠道微环境与淋巴系统相互作用开启了新可能。
1 引言
肠道作为人体最大的消化器官，持续暴露于外来抗原、饮食和环境微生物中，并包含免疫系统最广泛的淋巴组织。其免疫功能直接影响多种疾病的进展。活体成像技术，特别是显微内窥镜，为研究肠道疾病及相关免疫反应提供了有效手段。然而，传统可见光或近红外一区(NIR-I)显微内窥镜因光散射和组织自发荧光强，成像深度通常局限于粘膜层，难以对肠壁肌层或肠外毗邻组织（如腰淋巴结）进行高分辨成像。近年来，近红外二区(NIR-II, 1000–3000 nm)荧光成像凭借在更长波长下更低的散射和更弱的自发荧光，展现出更深的穿透深度、更高的对比度和更优的分辨率，为深部组织成像带来了希望。但现有的NIR-II成像模式通常用于从动物体表成像，对肠道等内部腔道或组织的无创细胞分辨率成像仍具挑战。
2 结果
2.1 具有大视场的NIR-II显微内窥镜
研究团队自主研发了一套NIR-II显微内窥成像系统，包括一台NIR-II宽场显微镜和一个基于梯度折射率(GRIN)透镜的显微内窥镜。为了一次性成像整个尺寸约1.8 ± 0.3 mm的腰淋巴结，团队对传统内窥镜进行了关键改进：将一个边长1.5 mm的直角棱镜（传统棱镜边长为0.7 mm）粘附在GRIN物镜末端，用于侧视成像。这一设计将成像视场(FOV)扩大了1.5倍，达到2.1 × 1.7 mm2，且不影响空间分辨率。在体成像时，小鼠仰卧于电动平移台上，一个末端带有紫外固化胶滴的方形玻璃引导管（玻璃管1）首先被插入直肠以提供引导和保护。随后，封装在另一个玻璃管（玻璃管2）中的GRIN显微内窥镜被插入引导管，从而可在肠腔内轴向移动和旋转，实现清晰成像。
2.2 NIR-I、NIR-IIa和NIR-IIb窗口的活体显微内窥镜成像
为了比较不同光谱波段的成像性能，研究使用了三种生物相容性NIR-II探针：TSEH（发射900-1300 nm）、CTTIC（发射1000-1400 nm）和PEG化的PbS/CdS量子点（发射1400-1900 nm）。在NIR-I窗口（900-1000 nm，使用TSEH）成像时，仅能清晰分辨粘膜层的浅表毛细血管网。而在NIR-IIa（1100-1400 nm，使用CTTIC）和NIR-IIb（1500-1700 nm，使用PbS）窗口，则可以观察到粘膜层更深处的肌层血管分支，甚至肠壁外的血管。NIR-II显微内窥视频捕获了由肠道蠕动驱动的、肠壁内外不同层次血管网络的相对运动。这种成像能力的提升归因于更长波长下信号衰减更慢、光散射更弱。测量显示，在NIR-II窗口下，最小肠道血管的横向半高全宽(FWHM)为8.68 ± 0.26 μm，接近理论估计分辨率。
2.3 经完整直肠壁无创成像腰淋巴结
腰淋巴结对腹部、盆腔器官和下肢具有引流功能，是常见的转移部位，但其位置深在，传统成像方法难以无创观察。研究通过在肛周皮下注射有机染料CNTIC-4F标记淋巴系统，首次利用NIR-II显微内窥镜，透过厚度300-600 μm的健康小鼠完整直肠壁，实现了对腰淋巴结的无创、高分辨率成像。在距肛门约22 mm和25 mm处，通过轻微旋转内窥镜，分别观察到了腰淋巴结，并清晰分辨了其中的B细胞滤泡或T细胞区。进一步，通过静脉注射TSEH标记血管、皮下注射CTTIC标记腰淋巴结的双通道成像，揭示了腰淋巴结与周围血管的相对位置关系。
2.4 对荷瘤小鼠腰淋巴结的无创NIR-II显微内窥镜成像
为观察肿瘤向腰淋巴结的引流，研究在BALB/c裸鼠腹部和肛周皮下接种了4T1乳腺肿瘤。肿瘤接种7天后，瘤内注射CTTIC纳米荧光团。注射15分钟后，NIR-II宽场成像因肿瘤信号干扰，无法清晰观察CTTIC向腰淋巴结的引流。而NIR-II显微内窥镜则成功捕获了CTTIC在腰淋巴结内及周围淋巴管网络中的实时运输过程。观察到淋巴以约120 ± 40 μm/s的速度从被膜下窦流向髓窦，并通过输出淋巴管流出。在荷瘤小鼠中，观察到腰淋巴结内淋巴流动不规则、间歇性，并伴有流动模式的波动和方向逆转，这可能与肿瘤侵袭导致的淋巴系统功能障碍有关。成像的CTTIC纳米荧光团的横向FWHM为9.03 ± 1.01 μm，表明达到了细胞级分辨率。
2.5 对TNBS诱导结肠炎小鼠的活体NIR-II显微内窥镜成像
炎症性肠病(IBD)的早期识别和新疗法开发需要新型成像手段。研究对健康小鼠和TNBS诱导的急性结肠炎小鼠进行了纵向成像。在静脉注射CTTIC后立即成像，NIR-II宽场成像在健康与结肠炎小鼠间未见明显差异，但NIR-II显微内窥镜显示，结肠炎小鼠直肠多个部位出现了因CTTIC从受损血管漏出导致的强烈、不规则荧光模式，指示了正常隐窝结构的破坏。注射24小时后，宽场成像和显微内窥镜均显示结肠炎小鼠直肠信号强烈而持久，而健康小鼠信号可忽略。更重要的是，在直肠内给予TNBS后立即静脉注射CTTIC，显微内窥镜即可在直肠多个部位检测到因毛细血管快速损伤导致的CTTIC漏出和异常荧光模式，实现了对TNBS诱导急性结肠炎的最早期检测，这是传统方法难以实现的。
研究进一步通过双通道成像（皮下注射PbS标记腰淋巴结，静脉注射CTTIC）观察了结肠炎对腰淋巴结的影响。离体宽场成像和活体显微内窥镜成像均显示，结肠炎小鼠腰淋巴结中的CTTIC信号强度约为健康小鼠的两倍，这归因于病灶处漏出的CTTIC引流至了腰淋巴结。
3 结论
本研究成功开发了NIR-II显微内窥镜，将内窥镜成像波长延伸至~1700 nm，首次实现了对肠道等内部腔道或组织的无创、在体、单血管或细胞分辨率成像。该系统有效抑制了光散射和组织自发荧光，清晰可视化了粘膜层以外的肠道肌层及肠周血管，并凭借优化的、大于既往内窥镜的视场，首次透过完整肠壁实现了对腰淋巴结的无创高分辨成像。研究实时观察到了由肠道蠕动驱动的不同肠层血管的相对运动，以及腰淋巴结中不规则的淋巴流。在TNBS诱导的IBD模型中，NIR-II显微内窥镜实现了以单血管分辨率对肠道病灶及其向腰淋巴结引流的纵向研究。这项工作为研究肠道微环境与淋巴系统的相互作用开辟了新的可能性。
4 方法
4.1 NIR-II显微内窥镜设置
使用直径1 mm的GRIN透镜和边长1.5 mm的镀铝直角微棱镜制作侧视显微内窥镜。采用双透镜结构，设计工作距离为5 mm。棱镜粘附在玻璃管末端，再套在GRIN透镜上。激光经光束整形、二向色镜反射、10倍物镜聚焦后耦合进GRIN内窥镜产生均匀宽场照明。荧光被GRIN内窥镜和宽场显微镜收集，经不同滤光片过滤后由铟镓砷(InGaAs)相机记录。
4.2 NIR-II荧光探针
使用了有机小分子染料TSEH、CNTIC-4F、CTTIC和PbS量子点。动态光散射(DLS)测量显示CTTIC纳米荧光团的平均流体力学尺寸为60 nm。
4.3 小鼠处理与肿瘤接种
所有动物实验均经香港大学动物实验伦理委员会批准。使用异氟烷麻醉小鼠。随机选择小鼠进行实验，成像前用脱毛膏去除毛发。
4.4 TNBS诱导结肠炎小鼠的制备
将50 μL 5% TNBS溶液与50 μL无水乙醇混合，用灌胃针经肛门注入直肠约3 cm深处，注射后保持小鼠头低尾高体位60秒。
4.5 活体显微内窥镜准备
成像前用PBS缓冲液冲洗和润滑结肠和直肠。引导管和显微内窥镜均用75%乙醇消毒。小鼠仰卧于电动平移台上，通过调整平移台使内窥镜逐渐进入直肠。
4.6 腰淋巴结的活体NIR-II显微内窥镜成像
在肛周皮下注射CNTIC-4F或PbS标记腰淋巴结，静脉或瘤内注射CTTIC标记血管或观察淋巴引流。注射后特定时间，将内窥镜插入直肠超过20 mm，并将棱镜朝向脊柱方向进行观察和旋转定位。
4.7 活体NIR-II宽场成像
使用二维InGaAs相机记录。根据所用探针，使用不同波长的激光（如808 nm, 915 nm, 975 nm）激发，并用相应的长通或带通滤光片收集荧光。
4.8 统计与数据分析
原始数据在ImageJ中处理，运动伪影使用Fiji中的插件校正。使用MATLAB或OriginLab进行数据分析，图中平均值和标准差使用OriginLab计算。
