优化碱基编辑器的连接子长度，以实现精准的作物育种和基因治疗

《Journal of Genetics and Genomics》：Optimizing linker length of base editors for precise crop breeding and gene therapy

碱基编辑通过连接酶与Cas9 nickase的短连接子（7个氨基酸）显著减少旁路编辑，平均降低54.4%，提升作物育种和基因治疗中编辑精度。

石圆圆|袁旭欣|秦朗|周芳芳|吴国川|李百涛|姚鹏程|史明燕|马琳莎|王毅|张媛|王晨|王学燕|黄蓓|陈杰|向志明|林秋鹏|黄家英

广东医科大学-广东中医药大学联合生命科学学院附属番禺中心医院放射科，广东省蛋白质修饰与疾病重点实验室，粤港澳大湾区细胞命运调控与疾病联合实验室，中国广东省广州市511436

摘要

碱基编辑技术能够在不引起DNA双链断裂（DSB）或不需要外源供体DNA模板的情况下高效地进行核苷酸转换。然而，其较宽的编辑窗口往往会导致旁观者编辑（即非目标位置的基因修饰），从而增加意外突变的风险。在本研究中，我们发现连接子长度显著影响编辑窗口的大小，使用7个氨基酸组成的连接子的碱基编辑器在水稻和人类细胞系中的13个内源性基因位点上将旁观者编辑减少了平均54.4%。我们进一步通过调整不同脱氨酶与Cas9切口酶之间的连接子长度，开发出了一种优化策略，有效减少了多种应用中的旁观者编辑现象，包括功能研究、精准作物育种以及病原体变异的修复。我们的工作表明，缩短连接子长度可以提高碱基编辑的特异性，解决了其在农业和治疗应用中的关键安全问题。

引言

单核苷酸变异（SNVs）对作物农艺性状的变异（Zhao等人，2011年）和人类遗传疾病（Hu等人，2018年）具有重要影响。与其他需要DNA双链断裂或供体模板的基因编辑技术不同，碱基编辑器（BEs）能够高效实现单核苷酸替换（Komor等人，2016年）。先进的碱基编辑器BE4max是通过将一种进化型的胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶与化脓性链球菌 Cas9切口酶（nSpCas9）连接而成的（Koblan等人，2018年）。最初的碱基编辑器仅限于C·G到T·A和A·T到G·C的转换（Komor等人，2016年；Gaudelli等人，2017年）。随着技术的进步，包括对DNA修复途径的修改以及使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）（Tong等人，2024年）、甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）（Tong等人，2023a，2023b）等酶，现在可以直接编辑腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），从而实现了所有12种类型的点突变，大大扩展了碱基编辑器的应用范围。这些工具推动了基因功能研究（Kuscu等人，2017年；Yuan等人，2018年）、基因治疗（Komor等人，2016年；Liang等人，2017年；Zeng等人，2018年）、动物模型构建（Liu等人，2018年；Wang等人，2020年；Hu等人，2025年；Zhong等人，2025年）和精准育种（Zong等人，2017年；Li等人，2018年，2021年；Huang等人，2023年）的发展，凸显了它们在研究和生物技术中的不可或缺性。

尽管碱基编辑器在各种应用中表现出高效率，但其较宽的编辑窗口限制了精准编辑的进展（Komor等人，2016年）。编辑窗口指的是脱氨酶在单导向RNA（sgRNA）引导下能够有效催化碱基修饰的区域，通常覆盖几个到十几个碱基。当该窗口内存在多个可编辑的碱基时，脱氨酶会非选择性地修饰所有可访问的碱基，导致旁观者编辑。例如，乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）（Findlay等人，2018年）和β-地中海贫血基因位点HBB（Liang等人，2017年）在活性窗口附近包含多个胞嘧啶（Cs），这些“旁观者碱基”容易发生意外编辑，从而影响碱基编辑的精准性。

在碱基编辑系统中，连接子对于将催化结构域（脱氨酶）与靶向结构域（Cas9蛋白）连接起来至关重要，以确保编辑的精准性和效率。第一代碱基编辑器由David Liu团队开发，使用了16个氨基酸组成的XTEN连接子（Komor等人，2016年）。后续的优化版本BE4max引入了改良的核定位信号（NLS）、32个氨基酸组成的连接子以及优化的密码子序列，提高了编辑效率（Koblan等人，2018年）。先前的研究表明，连接子长度和刚性都会影响碱基编辑的窗口和效率（Tan等人，2019年；Kuang等人，2021年；Zhao等人，2022年；Feola等人，2024年）。然而，目前我们对连接子属性如何影响编辑机制的理解仍然有限。大多数现有编辑器依赖经验确定的固定连接子长度，这限制了通过调整连接子长度来减轻旁观者效应的潜力。

因此，我们系统地研究了连接子长度如何调节碱基编辑效率和编辑窗口。我们开发了一种可调节的碱基编辑系统，通过改变连接子长度来调控编辑窗口。我们发现，将连接子长度缩短至7个氨基酸可以在保持目标编辑效率的同时显著缩小编辑窗口，从而减少旁观者效应。基于这些发现，我们开发出了高效且精确的碱基编辑器，适用于作物育种和基因治疗。进一步验证表明，这一策略适用于多种脱氨酶。

在水稻原生质体和再生植物中的实验表明，该系统在多个基因位点上提高了编辑精准度，有效减少了旁观者氨基酸变化，降低了早终止密码子的出现，并最小化了可变剪接的干扰。此外，我们在13个测试位点上成功修复了病原体SNVs，意外编辑减少了93.0%。总之，我们开发的短连接子碱基编辑器在推进精准作物育种和基因治疗方面具有巨大潜力。

连接子长度调节编辑窗口宽度

我们假设脱氨酶与nCas9之间的连接子长度会影响编辑窗口，进而影响碱基编辑的精准性。为了验证这一假设，我们首先将之前鉴定出的高效胞嘧啶脱氨酶miniSdd7整合到经典的BE4max架构中，该架构使用的是32个氨基酸组成的连接子（Koblan等人，2018年；Huang等人，2023年）。然后我们修改了miniSdd7与nSpCas9之间的连接子长度，构建了七个质粒

讨论

以往对碱基编辑器（如BE4max）的优化工作大多忽略了32个氨基酸连接子对旁观者编辑的影响。虽然最近的研究表明刚性连接子可以减少此类意外编辑（Tan等人，2019年），但我们的发现表明，简单地缩短连接子长度就能达到类似的效果，而且连接子长度对编辑精准性的影响比刚性或灵活性更为显著（图S1）。基于此，我们开发了一种通用策略来调节

质粒构建

对于植物和人类碱基编辑器载体，分别使用了pnCas9-PBE（Addgene#98164）和APOBEC1-BE4max（Addgene#152989）作为骨架。关键的脱氨酶（如miniSdd7、TadA8e）和Cas9变体（如nSpCas9-SpG、nSpCas9-SpRY）经过密码子优化，适用于水稻或人类细胞，并通过商业途径合成后克隆到这些骨架中。相应的sgRNA表达载体分别使用Oryza sativa OsU3和Homo sapiens hU6启动子构建（

未引用参考文献

Hu等人，2025a；Hu等人，2025b；Wang等人，2020a；Wang等人，2020b。

CRediT作者贡献声明

石圆圆和袁旭欣：概念构思、研究设计、数据分析、验证、撰写——初稿。秦朗：方法学设计、软件开发、数据分析、可视化。周芳芳、陈杰、王晨、向志明：资源准备。吴国川、姚鹏程、王毅、张媛、王学燕、黄蓓：研究实施、验证。史明燕和马琳莎：数据分析、数据管理。李百涛：方法学设计、软件开发。林秋鹏和黄家英：撰写、审稿与编辑。

数据可用性

本研究的深度测序数据（植物和人类样本）已存入中国国家生物信息中心（CNCB）的国家基因组数据中心（NGDC）的基因组序列档案（GSA）和GSA-Human，分别编号为CRA037428和HRA016792。

利益冲突

作者已基于本文报告的结果提交了一项专利申请。

致谢

本研究得到了STI 2030重大项目（2023ZD04074）、国家自然科学基金（32422050和32401250）、国家重点研发计划（2024YFC3408200和2024YFF1000800）、中国科学技术协会青年精英科学家资助计划、广东省“珠江人才计划”创新创业团队项目（2023ZT10N019）、广西壮族自治区国家重点研发计划（GKN AB24153006）等项目的支持。