一种通过酶引导策略筛选降解三氯卡班的微生物的富有洞察力的方法：Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans的解毒调控与能量代谢

三氯生（TCC）生物降解研究通过酶引导的筛选策略从5000余菌株中选出Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans (DP)，其48小时内降解26.0% TCC并同步降解毒性中间产物，通过LPS修饰、外排泵及酶催化等多机制解毒，能量代谢转向丙酸代谢和三羧酸循环，适应营养限制与低浓度TCC胁迫。

　　

李崇树|王长来|卢启英|张洁|严龙|叶金绍

中国广东省济南市济南大学环境与气候学院，广东省广州市510632，广东省环境暴露与健康重点实验室

摘要

生物降解对于清除受污染环境中的三氯卡班（TCC）至关重要。然而，目前仅分离出少数能够降解TCC的纯培养菌株，且降解过程中涉及的细胞毒性和解毒机制仍不甚明了。基于富集培养的传统筛选方法效率低下。本研究利用现有的功能性酶信息、生物信息学数据库、微生物集合及生物信息学工具，探索了高通量筛选潜在降解TCC的功能细菌的可行性，并系统研究了TCC引起的细胞毒性和解毒反应。从超过5000株候选菌株中筛选出8株代表性菌株，其中Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans（DP）在48小时内可降解1 mg/L TCC及其水解产物3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）和4-氯苯胺（4-CA）的26.0 ± 0.70%。在TCC胁迫下，DP保持了膜完整性和存活率（TCC处理组分别为7.42% ± 1.36%和94.28% ± 0.53%，而对照组分别为4.75% ± 0.28%和95.15% ± 0.97%），尽管活性氧（ROS）水平升高。TCC暴露增强了丙酸代谢、TCA循环和电子传递链活性，使能量分配从生物合成转向应激反应和生存。DP采用了多种解毒机制，包括脂多糖（LPS）修饰、膜通透性改变、外排泵作用和酶催化。关键能量代谢物（如果糖-1,6-二磷酸、乙酰辅酶A和α-酮戊二酸）的浓度在TCC胁迫下降低。DP通过丙酸代谢途径补充了琥珀酸和丙酮酸。本研究为筛选降解有机污染物的新细菌提供了新的视角，并揭示了TCC胁迫下代谢网络的调控机制。

引言

三氯卡班（TCC）是一种广泛用于个人护理和家用产品中的广谱合成抗菌剂，因其具有内分泌干扰作用、环境持久性和生态毒性而备受关注[1]。据估计，中国每年TCC和另一种抗菌剂三氯生（triclosan）的总消耗量约为1200吨[2]。由于其亲脂性和生物累积潜力，TCC可能发生长距离传输[3]，并在各种环境样本、植物、动物甚至人体样本中被检测到[1]。中国中部城市污水中的TCC浓度范围为60–760 μg/L[4]。生态风险评估表明，TCC对亚洲海洋生物的威胁比欧洲或北美更大[5]。这些负面影响凸显了迫切需要有效的可持续修复策略来清除受污染环境中的TCC。

虽然光解可以减轻TCC的毒性，但在浑浊的废水中效果不佳[1]。生物降解是一种更有前景且环境友好的去除方法；然而，目前分离出的降解TCC的细菌较少，包括属（YL-JM2C, LY-I）[6]、[7]、属（MC22, TCC-2, TCC-1）[8]、[9]、[10]、 BX2[11]和 MC46[12]、[13]。值得注意的是，这些研究使用的TCC浓度（4–20 mg/L）远高于环境中的实际浓度。例如， TCC2在24小时内可水解10 mg/L TCC的96.88%，但同时产生了有毒的3,4-DCA和4-CA[10]，这些物质可能造成二次污染。因此，这些水解产物的进一步降解往往是完全解毒的限制因素[11]，这凸显了在实际环境基质中实现高效生物降解的必要性。

由于外膜的屏障作用，革兰氏阴性细菌能够抵御TCC的侵害。 ATCC 10536对TCC的最小抑制浓度超过5 μg/mL，且未观察到膜损伤[14]。 PD1222无法降解TCC，在50 μg/L TCC浓度下完全抑制了反硝化作用[15]。我们之前的研究表明，尽管 ATCC 8739不能水解TCC，但在含有0.4 g/L葡萄糖的M9培养基中暴露于0.1 μM TCC 12小时后，会诱导出可逆的适应性反应，包括外排泵激活、细胞分化和LPS合成[16]。因此，有效的TCC降解菌可能依赖于主动的解毒机制（如酶促降解或外排作用），而不仅仅是外膜屏障功能。值得注意的是，在无葡萄糖条件下（0.36 g/L），TCC的降解效率更高[10]，这可能是由于碳代谢产物的抑制作用。然而，目前尚不清楚功能细菌如何在低TCC浓度下调节能量代谢以维持解毒和细胞活性。

传统上，功能性微生物的筛选主要依赖于经典培养方法[17]，这些方法耗时且结果不确定性较大。基于酶的筛选方法可能为解决这些问题提供新的思路。例如， TCC2中的酰胺酶TccA负责TCC的初始水解[10]， BX2中的同源蛋白TccS也具有相同功能[11]。鉴于同源蛋白在不同物种间通常具有保守的功能，我们假设TccA/TccS的同源序列可以作为分子标记，快速从微生物数据库和菌株集合中识别潜在的TCC降解菌株，从而克服基于培养方法的局限性。分子生物学和多组学技术的进步，以及UniProt和NCBI等数据库中日益丰富的微生物基因组和蛋白质数据，为基于同源性的高通量筛选功能微生物奠定了基础。

本研究通过基于酶的生物信息学筛选方法发现了潜在的TCC降解菌。在候选菌株中，兼性需氧菌（DP）在M9培养基中48小时内表现出最高的TCC降解能力，并在四种测试条件下均保持稳定的降解性能，因此被选为进一步研究对象。本研究旨在（1）评估基于酶的筛选方法识别功能性降解菌的可行性；（2）通过流式细胞术和转录组分析阐明TCC诱导的防御和解毒反应；（3）通过结合转录组学和代谢组学，揭示营养限制条件下支持TCC降解的能量代谢适应性。

章节片段

挖掘潜在的TCC降解微生物

已证实酰胺酶TccA（GenBank: ANB41810.1，Text S1）负责TCC的水解[10]，[15]，我们利用它作为参考来识别可能具有TCC水解能力的同源蛋白。首先从UniProt或NCBI数据库中检索TccA的氨基酸序列，然后使用基本局部比对工具（BLAST，v2.15.0）进行序列比对，以搜索蛋白质数据库中的同源蛋白。

潜在TCC降解菌的TCC生物降解

如图1A所示，所有8株菌株均能在M9培养基中48小时内降解1 mg/L的TCC，降解效率分别为：O.sp 19.7±0.8%、DP 26.0±0.7%、SV 17.41±1.0%、SC 10.7±0.9%、PC 16.6±1.6%、PP 20.1±2.4%、RR 23.2±2.1%和RE 12.9±0.9%。O.sp和RR的降解结果与之前关于 TCC-2[10]和 BX2[11]的报告一致。这些结果验证了我们筛选策略的有效性。

结论

本研究验证了基于酶的生物信息学策略在挖掘能够降解合成抗菌剂（如TCC）的功能细菌方面的有效性。作为选定的8株菌株之一，DP同时表现出对TCC及其有毒中间体的水解能力，显示出其在TCC污染环境中的生物修复潜力。同时，1 mg/L TCC的暴露会导致DP中ROS的显著积累，从而导致DNA损伤。

环境影响

三氯卡班（TCC）是一种新兴污染物，对生态系统和人类健康构成潜在风险。为克服传统功能性微生物筛选方法（如周期长和效率低）的局限性，本研究开发了一种高通量筛选策略来识别潜在的TCC降解微生物。

CRediT作者贡献声明

叶金绍：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。严龙：撰写、审稿与编辑、监督。王长来：数据可视化、验证、实验研究。李崇树：原始稿撰写、数据可视化、实验研究。张洁：数据可视化、实验研究。卢启英：软件应用、数据管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：叶金绍表示得到了济南大学的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（项目编号22576080）的财政支持。