《Journal of Hepatology》：Asynchronous Transitions from High-Risk Hepatoblastoma to Carcinoma
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为解决具有肝母细胞瘤(HB)与肝细胞癌(HCC)混合特征的儿科肝脏肿瘤(肝母细胞瘤伴癌特征，HBC)的生物学本质、细胞组成及不良预后机制不明确的问题，本研究通过多组学（snRNA-seq、snDNA-seq、多区域纵向测序等）深度解析。结果揭示了HBC由异质性的HB样、HBC样和HCC样细胞组成，起源于肝干细胞早期分化阶段，其分化停滞与持续异常的WNT信号通路激活相关。WNT信号抑制可促进细胞分化并增强对顺铂的敏感性。该研究为理解HBC的演化和制定靶向分化疗法提供了关键洞见。
在儿科肝脏肿瘤的世界里，肝母细胞瘤(HB)和肝细胞癌(HCC)是两个最主要的“主角”，它们有着不同的分子特征和临床行为。然而，临床上还存在着一类让人困惑的“灰色地带”肿瘤——它们兼具HB和HCC的组织学和分子特征，被归为肝母细胞瘤伴癌特征(HBC)或暂定为“肝细胞性肿瘤-非特指型(HCN-NOS)”。这类肿瘤的生物学本质究竟是什么？它们仅仅是HB细胞和HCC细胞的简单混合物，还是包含了一种独特的、具有混合特征的“HBC细胞”？为什么HBC患者的预后往往比典型的HB更差，对化疗的抵抗性更强？这些问题长期以来悬而未决，制约了精准诊断和有效治疗策略的发展。为了揭开HBC的神秘面纱，来自德州儿童医院癌症中心的研究团队开展了一项深入的多组学研究，其成果发表在《Journal of Hepatology》上。
为了探究上述问题，研究人员整合运用了多种前沿技术。他们构建了一个包含42例HBC患者的队列，其中多数样本为化疗后切除组织。关键技术方法包括：单细胞核RNA测序(snRNA-seq)和单细胞核DNA测序(snDNA-seq)，用于在单细胞分辨率下解析肿瘤的转录组和基因组异质性；多区域纵向批量RNA和DNA测序，用于追踪肿瘤的空间异质性和进化动态；以及NanoString批量RNA表达谱分析。此外，研究还利用了患者来源的HBC细胞系HB17进行体外功能实验，以验证WNT信号通路的作用。
研究结果
HBC outcomes are poor (HBC临床预后差)
通过比较42例HBC患者与多个大型HB队列的临床数据，研究人员发现HBC患者的无事件生存率和总生存率均显著差于HB患者。HBC的五年总生存率平均仅为43%，而HB平均为79%。这确立了HBC作为一种高风险疾病实体的临床地位。
HBC resections contain HBC cells (HBC切除样本中含有HBC细胞)
为了确认是否存在兼具HB和HCC分子特征的细胞，研究团队开发了一个基于基因表达的HB-HCC分类器。将该分类器应用于多个HBC切除样本的单细胞转录组数据，结果在所有分析的HBC中均检测到了HBC细胞（即同时高表达HB和HCC特征基因集的细胞）。在HBC肿瘤中，HBC细胞占所有恶性细胞的51%以上，而HB样本仅含HB细胞，经过强化治疗的HBC活检样本则以HCC细胞为主。
Both HB and HCC signature genes are upregulated in HBC cells (HB和HCC特征基因在HBC细胞中均上调)
进一步分析显示，HBC细胞在转录组谱上构成了一个从HB样到HCC样的连续谱系。其中一些细胞更接近HB，一些更接近HCC，另一些则在转录水平上与两者都不同。这表明HBC并非简单的细胞混合物，而是包含了一种具有过渡特征的细胞状态。
High-risk HB, HBC, and HCC cells are less differentiated (高风险HB、HBC和HCC细胞分化程度更低)
研究人员建立了一个模型，基于人胚胎肝细胞单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据推断肝脏细胞的分化阶段。他们发现，治疗前的HB主要由处于较晚胚胎分化阶段的细胞组成，而儿科HCC和HBC则富含处于更早期（即更不分化）胚胎阶段的细胞。重要的是，HBC的分化程度显著低于低风险HB。处于早期分化阶段的细胞往往更静止，这与化疗抵抗性相关。LIN28B（一种早期发育状态的标志物）的表达与分化阶段和临床风险类别显著相关。
Aberrant WNT-signaling activation regulates HBC embryonic differentiation (异常的WNT信号激活调控HBC的胚胎分化)
WNT通路基因的DNA改变在几乎所有的HB和HBC中驱动了持续的WNT激活。研究发现，HBC中WNT活性标志物DKK1的表达持续升高。功能实验表明，用WNT抑制剂ICG-001或WNT-C59处理患者来源的HBC细胞系HB17，能够显著降低DKK1和LIN28B的表达，并促使细胞向更分化的状态转变。单细胞转录组分析证实，WNT抑制诱导了HB17细胞的分化，且这种分化在抑制剂撤除后仍得以维持。
WNT-signaling inhibition sensitizes HBC cells to cisplatin by promoting cell differentiation (WNT信号抑制通过促进细胞分化增强HBC细胞对顺铂的敏感性)
由于未分化细胞更耐药，研究团队开发了一个模型，用于从RNA表达谱推断对顺铂（儿科肝癌标准疗法组成部分）的耐药性。该模型预测HCC细胞比HB细胞更耐药，而HBC细胞簇的平均顺铂耐药性高于HB。在HB17细胞中，LIN28B表达与顺铂耐药评分显著相关。重要的是，WNT抑制剂ICG-001处理降低了细胞的平均化疗耐药评分。联合治疗实验证明，低毒性剂量的ICG-001预处理，能显著增强后续顺铂治疗对HB17细胞的杀伤效果。5), cisplatin (IC0or IC10), or combination treatments compared with untreated controls.">
HBCs are derived from HBs at early hepatic stem cell development stages and transition to HCC (HBC起源于肝干细胞发育早期的HB并向HCC转化)
通过整合多区域全外显子组测序、snDNA-seq和snRNA-seq数据，研究人员重建了多个HBC肿瘤的系统进化树。结果显示，每个HBC肿瘤内都存在多个遗传学上不同的亚克隆，而每个亚克隆内部都同时包含HB、HBC和HCC三种分子类型的细胞，并且这些细胞都富集在肝干细胞分化的早期阶段。鉴于不同肿瘤类型和分化状态的细胞独立、重复地获得完全相同遗传改变的概率极低，这些进化树强有力地表明，在每个HBC肿瘤内部，从HB到HBC，再从HBC到HCC的转化是异步、多次发生的，且这些转化事件起源于肝干细胞分化的极早期阶段。
研究结论与意义
本研究通过对HBC进行深入的多组学剖析，得出了几个核心结论。首先，HBC在细胞水平上是HB样、HBC样和HCC样细胞的异质性混合体，其中HBC细胞占主导，这解释了其混合的分子特征。其次，HBC细胞起源于肝干细胞发育极早期阶段的分化停滞的HB前体细胞。第三，这种分化停滞依赖于持续异常的WNT信号通路活性，抑制该通路可促进HBC细胞分化，并增强其对标准化疗药物顺铂的敏感性。第四，也是最具颠覆性的发现是，每个HBC肿瘤都代表了多个HB-to-HBC和HBC-to-HCC异步转化事件的动态过程，揭示了其复杂的进化本质。
这项研究的意义重大。它首次在单细胞和进化层面上系统阐明了HBC这类“模糊”肿瘤的生物学本质，将其从一个简单的形态学分类提升为一个具有明确细胞起源和分子驱动机制的动态疾病过程。研究不仅解释了HBC预后差、化疗抵抗性强的原因（与早期未分化状态相关），更重要的是，提出了一个潜在的治疗新策略：通过WNT信号抑制剂解除分化阻滞，使顽固的肿瘤细胞“成熟化”，从而恢复其对传统化疗的敏感性。这为改善这类高风险儿科肝癌患者的治疗结局带来了新的希望。当然，研究也存在局限性，如样本大多来自化疗后、未能精确评估化疗诱导的基因组改变的作用等，未来需要在更大队列和更多治疗前样本中验证，并探寻驱动HB向HBC转化的具体分子机制。尽管如此，该工作无疑为儿科肝脏肿瘤的精准医学迈出了关键一步。
