癌症继续对全球公共卫生构成严重威胁，传统的治疗策略常常受到药物耐药性和系统毒性的限制[1]。这一持续的临床挑战推动了从天然来源中寻找新型抗癌剂的研究，1981年1月1日至2019年9月30日期间全球批准的化疗药物中约有60%来源于天然产物或其衍生物[2]。在各种植物化学物质中，萘醌类化合物因其独特的氧化还原循环特性和结构多样性而受到广泛关注，这使得它们能够通过多种机制发挥抗癌作用[3,4]。特别是呋喃萘醌类化合物，由于具有萘醌核与一个或多个呋喃环的结合结构，通过调节STAT3信号通路或激活线粒体通路等方式表现出显著的抗癌活性，因此成为抗癌药物开发的研究焦点[[5], [6], [7], [8], [9], [10]]。
Markhamia属（紫葳科）包括多年生树木或灌木，世界植物在线数据库（WFO）中记录了该属的五个物种[11]。其中M. stipulate（Roxb.）Seem.及其变种M. stipulate var. kerrii（Kurz）Sprague和M. stipulate var. velutina（Kurz）Sprague在中国有分布[12]。Markhamia属植物在非洲传统医学中被视为重要资源，其根、茎、叶和树皮等部位被用于治疗多种疾病，如疼痛、疟疾、风湿病、呼吸道感染和消化系统疾病[[13], [14], [15]]。在中国，《本草纲目》中首次将Markhamia植物（中文称为毛味木）记载为民间药物，认为其具有清热、解毒、凉血和活血化瘀的功效[16]。此外，《广东省常用中草药》中提到Markhamia根的水提取物可用于治疗淋巴癌、淋巴结炎、扁桃体癌、肝炎和肝硬化。
自Joshi等人在1978年首次对Markhamia stipulata进行化学研究以来[17]，对该属的研究已经持续了四十多年。当前的研究表明Markhamia属植物富含多种次生代谢物，包括醌类、苯乙酰苷和三萜类化合物，其中呋喃萘醌类化合物是具有多种显著生物活性的特征成分[[18], [19], [20], [21], [22]]。值得注意的是，M. stipulate的根在中国民间医学中常被用于治疗癌症。然而，对该植物的全面药理学和植物化学研究仍然有限，因此我们对M. stipulate的根进行了初步探索，以鉴定其关键的抗肿瘤成分并评估其性质。
从复杂的草药提取物中鉴定天然化合物是一项相当艰巨的任务。尽管现代分析技术，尤其是高分辨率质谱（HRMS）在结构测定方面取得了显著进展，能够提供高灵敏度和高通量的分子量和片段结构数据，但对于未知化合物而言，质谱数据的分析仍然是一个耗时且具有挑战性的过程。然而，最近LC-HRMS/MS与分子网络技术的结合彻底改变了质谱数据分析的方式。分子网络分析基于MS/MS裂解数据的相似性对结构相似的分子进行聚类，显著减少了数据处理时间并提高了分析效率。因此，过去几十年中这种技术被越来越多地用于复杂天然产物的鉴定[23,24]。
因此，在本研究中，我们采用了基于生物测定评估和UHPLC-HRMS/MS分子网络分析的方法来研究M. stipulate根中的细胞毒性成分。通过体外细胞实验和H22肿瘤小鼠模型筛选，确认乙醇提取物中的二氯甲烷组分是最活跃的组分。随后，基于UHPLC-HRMS/MS分子网络分析的色谱分离技术帮助我们分离出了两种未知的呋喃萘醌类化合物markhanaphthofuranones A（5）和B（6），以及五种已知的类似物（1–4, 7），其中7的绝对构型首次被确定。进一步的对这些化合物的细胞毒性评估显示，1–4, 7和1是最具有潜力的候选分子。此外，初步的结构-活性关系分析表明，呋喃环上的2-乙酰基以及苯环上缺乏甲氧基或羟基可能是决定其细胞毒性的关键因素。本文报告了这些化合物的生物测定、UHPLC-HRMS/MS分子网络分析引导的分离过程、结构鉴定以及结构-活性关系。
