《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Curdione alleviates renal fibrosis through Fblim1-dependent inhibition of the TGF-β1/Smad3 signaling pathway
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姜黄素通过直接靶向Fblim1抑制TGF-β/Smad3通路发挥抗肾纤维化作用。研究在UUO小鼠和TGF-β1刺激的TCMK1细胞中证实，姜黄素剂量依赖性抑制α-SMA、纤维连接蛋白和I型胶原表达，同时抑制Fblim1表达及Smad2/3磷酸化。分子实验证实姜黄素与Fblim1直接结合（-6.7 kcal/mol），过表达Fblim1逆转姜黄素疗效。研究为CKD治疗提供新候选药物。
李倩倩|倪玉芳|李照阳|邹圆霞|郭怀英|王红莲|张琼|王莉|李建军
中国泸州西南医科大学附属中医院中西医结合医学研究中心
摘要
慢性肾脏病（CKD）会不可避免地通过肾小管间质纤维化进展为终末期肾病（ESRD），这一过程主要由转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD家族成员3（Smad3）信号通路驱动。虽然姜黄根中的主要倍半萜类化合物姜黄酮具有抗纤维化活性，但其具体在肾纤维化中的机制尚不清楚。在本研究中，我们使用单侧输尿管阻塞（UUO）小鼠模型和TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞（TCMK1）模型探讨了姜黄酮的保护作用。结果发现，25和100毫克/千克剂量的姜黄酮显著减轻了UUO引起的肾损伤和肾小管坏死，抑制了损伤标志物肾损伤分子-1（KIM-1），并剂量依赖性地抑制了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）和胶原蛋白I的表达。在TGF-β1刺激的TCMK1细胞中，姜黄酮也防止了纤维化形态变化，并抑制了促纤维化标志物的上调。机制上，姜黄酮在体内和体外均抑制了Filamin结合LIM蛋白1（Fblim1）的表达以及Smad2/3的磷酸化。关键的是，通过超声微泡介导的质粒递送在体内过表达Fblim1，并在体外得到验证，显著削弱了姜黄酮的抗纤维化效果并恢复了p-Smad3的水平。此外，分子对接预测其具有强烈的结合亲和力（-6.7 kcal/mol），而细胞热位移测定（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验证实姜黄酮直接与Fblim1结合，增强了其分子稳定性。总之，本研究从组织、细胞和分子层面提供了证据，表明姜黄酮通过直接靶向Fblim1，从而功能性地抑制TGF-β1/Smad3信号通路，发挥强大的抗纤维化和肾保护作用。这些发现使姜黄酮成为治疗CKD的有希望的天然候选药物。
引言
慢性肾脏病（CKD）是一个严重的全球公共卫生问题，其特征是肾功能进行性和不可逆的下降，最终导致终末期肾病（ESRD）[1]。全球约有10%的人口受到CKD的影响，它是主要的死亡原因之一，与心血管风险增加和健康相关生活质量显著下降密切相关[1]。CKD进展的病理标志和最终决定因素是肾小管间质纤维化，其严重程度与功能丧失直接相关[2,3]。转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD家族成员3（Smad3）信号通路是纤维化重塑的主要、非冗余的驱动因素[4]。具体而言，Smad3的激活是这一过程的核心；有充分证据表明，其基因敲除可提供强大的抗纤维化保护，而其持续激活会加速多种模型中的疾病进展[5,6]。因此，TGF-β/Smad3轴被广泛认为是阻止CKD的有效治疗靶点。尽管有这些强有力的证据，但仍然迫切需要能够安全且特异性地干扰这一关键通路的临床有效抗纤维化药物。
最近的研究越来越多地表明，天然化合物可以通过协调调节炎症、氧化应激和纤维化相关的关键信号通路来预防CKD。例如，含有阿魏酸的咖啡酸被证明可以通过抑制芳基烃受体（AHR）的核转位并调节下游核因子-κB（NF-κB）/核因子红系2相关因子2（Nrf2）信号通路，从而减轻腺嘌呤诱导的大鼠的CKD[7]。类似地，Geniposidic酸通过调节AHR介导的NF-κB/Nrf2通路，减轻了慢性肾小管间质肾病，降低了氧化应激并改善了肾功能[8]。Barleriside A作为AHR拮抗剂，通过同时减轻氧化应激和炎症保护足细胞，进一步突显了针对AHR信号通路在CKD中的治疗价值[9]。除了AHR相关的机制外，黄酮类化合物Fisetin通过特异性抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）介导的肾小管铁死亡，从而减少肾小管损伤、炎症反应和纤维化肾脏中的细胞外基质沉积[10]。总体而言，这些研究表明天然化合物可以通过多种互补的分子通路干预CKD的进展，为探索类似的生物活性物质在肾纤维化中的应用提供了有力的依据。
鉴于传统药物开发的有限成功，天然产物为新型治疗药物的发现提供了丰富且结构多样的资源。多项研究表明，这些天然化合物可以通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来减缓CKD的进展，这是肾纤维化的主要驱动因素[11]。姜黄酮是从姜黄根中提取的主要倍半萜类化合物[12]，先前已在多种病理模型中显示出有希望的作用，包括对局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护[13]，以及对抗氧化应激[14]、细胞凋亡[15]和铁死亡[16]的强大效果，例如在心肌梗死或心脏毒性模型中。重要的是，姜黄酮也被报道在肺部[17]和肝脏[18]纤维化模型中具有抗纤维化活性。这些发现强烈表明其治疗潜力扩展到了病理组织重塑。然而，尽管有这些关于其在其他器官中抗纤维化能力的累积证据，姜黄酮在肾纤维化中的具体作用——包括其精确的分子靶点和下游机制——尚未得到系统阐明。解决这一空白对于验证姜黄酮作为CKD的有效抗纤维化候选药物至关重要。
最近的研究强调了Filamin结合LIM蛋白1（Fblim1）是一个被低估但可能对细胞外基质动态和TGF-β信号通路具有关键调节作用的因子[19,20]。支持这一联系的一项最新研究表明，CAF（癌相关成纤维细胞）中Fblim1阳性的亚群与TGF-β表达增加、间充质标志物水平升高和免疫抑制性肿瘤微环境高度相关，表明Fblim1与TGF-β/Smad通路之间存在密切关联。此外，对肝纤维化的研究显示，敲低Fblim1显著抑制了TGF-β/Smad调控的肝纤维化。
鉴于姜黄酮之前已被证实参与调节TGF-β/Smad通路[17]，而Fblim1也被验证为该通路的调节因子[20]，我们假设姜黄酮可能通过调节Fblim1的表达和随后的TGF-β/Smad信号通路来发挥其抗纤维化作用。为了验证这一点，我们首先在单侧输尿管阻塞（UUO）小鼠模型和体外模型中确认了姜黄酮对肾纤维化的保护作用。在此基础上，我们发现姜黄酮显著改变了Fblim1的表达，并通过细胞热位移测定（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验确认了姜黄酮与Fblim1之间的直接结合。为了明确姜黄酮与Fblim1之间的功能关系，我们在体内和体外过表达Fblim1进行了拯救实验，以评估姜黄酮抗纤维化作用的机制。
材料
姜黄酮（Cur，目录号CFN99146，纯度≥98%，通过HPLC验证）购自ChemFaces有限公司（中国武汉）。Pirfenidone（PFD，目录号P129335）购自Aladdin生化技术有限公司（中国上海）。实验中使用的所有生化试剂均为分析级。
质粒构建和克隆
使用PCR聚合酶（目录号P505，Vazyme，中国）扩增了Fblim1的编码序列（CDS）。然后使用克隆试剂盒（目录号C115，Vazyme，中国）将此Fblim1 CDS无缝克隆到两个载体中。
姜黄酮在UUO模型中减轻UUO引起的肾小管损伤并抑制KIM-1表达
为了评估姜黄酮的潜在肾保护作用，首先对其化学结构进行了表征（图1A），然后通过UUO在小鼠中建立了急性肾损伤模型。使用H&E染色进行的组织病理学分析显示，与假手术对照组相比，UUO小鼠的肾损伤严重（图1B, 1D）。这种损伤表现为明显的肾小管扩张、结构紊乱、肾小管细胞坏死显著增加等。
讨论
慢性肾脏病的进展最终导致终末期肾病，肾小管间质纤维化是与其功能丧失直接相关的病理标志[28]。TGF-β/Smad信号通路是这种纤维化重塑的主要驱动因素，其持续激活是疾病加速的核心[4,29,30]。因此，靶向TGF-β/Smad3轴仍然是阻止CKD的有效策略。姜黄酮是从姜黄根中提取的主要倍半萜类化合物。
结论
总之，本研究系统地阐明了天然倍半萜类化合物姜黄酮在肾纤维化治疗中的独特作用机制。我们的工作明确证明了姜黄酮通过直接结合并抑制Fblim1，有效阻断了核心的TGF-β/Smad3纤维化信号通路。未来的研究应关注在更大动物模型或多种肾病理中的长期疗效和药代动力学，以加速转化研究。
伦理批准声明
所有实验程序均获得了西南医科大学动物伦理委员会的批准（批准编号20240715-041）。
作者贡献声明
李倩倩：撰写——初稿，监督。
倪玉芳：数据可视化，项目管理。
李照阳：数据可视化。
邹圆霞：方法学，正式分析。
郭怀英：软件，方法学。
王红莲：撰写——初稿，监督。
张琼：撰写——审阅与编辑，资源协调。
王莉：撰写——审阅与编辑，监督。
李建军：撰写——审阅与编辑，监督，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号82104665）、四川省科技计划（编号2026NSFSC0638）、泸州市人民政府与西南医科大学的联合项目（编号2024LZXNYKDJ020）以及西南医科大学的资助计划（编号2024ZXYZX05）的支持。
