《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Subacute ruminal acidosis induces inflammation, autophagy, and apoptosis by disrupting Ca2? homeostasis via STIM1/ORAI1 upregulation in mammary gland tissues
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高浓度饲料通过上调STIM1/ORAI1激活钙信号通路，导致绵羊乳腺组织炎症、自噬和凋亡。实验显示高浓度组乳腺组织Ca2?含量显著升高，通过CaMKKβ-NF-κB通路促进炎症因子表达，同时激活AMPK-mTOR通路诱导自噬，并上调凋亡相关蛋白表达。
孟美娟|任旭然|李学瑞|周善东|沈向珍|常光军
中国江苏省南京市南京农业大学兽医学院，邮编210095
摘要
亚急性瘤胃酸中毒（SARA）是反刍动物中常见的代谢紊乱疾病，可引发乳腺炎，而钙离子（Ca2?）平衡的破坏与乳腺疾病密切相关。本研究旨在通过探讨钙离子信号通路在SARA引发的乳腺损伤中的作用，包括其对炎症、自噬和细胞凋亡的调控机制。实验中，我们给Hu羊喂食高浓度（HC，70%精料）日粮（pH值低于5.6持续超过3小时），持续56天。实验结束后收集了动物的血液和乳腺组织样本。与低浓度（LC，30%精料）日粮相比，高浓度日粮增加了乳腺组织中STIM1和ORAI1的mRNA及蛋白质表达，并提高了乳腺组织中的Ca2?含量。升高的Ca2?激活了CaMKKβ-NF-κB通路，表现为p-IκB和p-p65的水平升高，促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的表达增加，以及ORAI1与p65之间的相互作用增强。同时，高浓度日粮还激活了CaMKKβ-AMPK通路，进而上调了与自噬相关的蛋白质表达并诱导自噬。最终，高浓度日粮通过上调促凋亡蛋白（细胞色素C、Cleaved-Caspase3和BAX）的表达及下调抗凋亡蛋白（Bcl-2）促进了细胞凋亡。综上所述，SARA通过上调STIM1/ORAI1表达，破坏了钙离子平衡，进而通过CaMKKβ介导的NF-κB和AMPK-mTOR通路引发了Hu羊乳腺中的炎症、自噬和细胞凋亡反应。
引言
高浓度日粮富含必需营养素，能有效满足反刍动物的营养需求。短期内增加日粮中精料的比例通常能带来积极效果，因此在繁殖期常被用于提高生产力和经济效益。然而，虽然高浓度日粮能短期内提升反刍动物的生产性能，但长期或过量摄入可能导致瘤胃中乳酸和挥发性脂肪酸的积累，从而引发亚急性瘤胃酸中毒（SARA），给畜牧业造成重大经济损失[1,2]。因此，在高密度饲养条件下实现生产性能与动物健康之间的平衡已成为亟待解决的关键问题。
钙离子（Ca2?）在细胞内作为第二信使，参与多种生理过程。细胞内Ca2?水平的紊乱可能导致多种疾病。Store-operated calcium entry (SOCE) 通道是细胞外Ca2?进入细胞的主要途径，主要由两种关键蛋白组成：stromal interaction molecule 1 (STIM1) 和 calcium release-activated calcium modulator 1 (ORAI1)[3]。先前研究表明，β-胡萝卜素可通过抑制STIM1和ORAI1来缓解LPS诱导的牛乳腺上皮细胞的内质网应激、线粒体损伤和细胞凋亡[4,5]。此外，白藜芦醇能抑制SOCE通道的组成成分STIM1和ORAI1的表达，从而减少细胞外Ca2?的流入，抑制ERK1/2信号通路的激活并减轻HEK293细胞的损伤[6]。我们的前期研究发现，高浓度日粮会上调STIM1和ORAI1的表达，进而引发奶牛乳腺组织的炎症反应和细胞凋亡[7]。进一步的体外实验证实，LPS通过增强STIM1和ORAI1的表达，激活NF-κB信号通路，导致牛乳腺上皮细胞发生炎症反应[8]。这些发现揭示了高浓度日粮通过调节钙离子信号通路引发乳腺组织炎症和细胞凋亡的潜在机制。
细胞内Ca2?浓度对于启动自噬至关重要，其升高水平是这一过程的强大刺激因素。这一复杂过程通过CaMKKβ-AMPK通路进行调控，该通路又抑制mTOR信号通路，从而有效调节自噬[9, [10], [11]。在缺乏LKB1的细胞中，细胞内Ca2?水平的升高可通过CaMKKβ通路激活AMPK磷酸化[12]。Zheng等人的研究证实Orai1在促进自噬过程中起关键作用[13]，具体而言，沉默Orai1可显著减少Angiotensin II诱导的LC3-II积累，并在体外和体内抑制心肌细胞的自噬[13]。因此，SOCE在维持细胞内Ca2?平衡中起着关键作用。然而，关于SARA条件下STIM1/ORAI1复合体介导的Ca2?流入及其通过CaMKKβ信号通路对机体的后续影响的研究仍较为有限。因此，有必要研究STIM1/ORAI1在Hu羊乳腺损伤中的调控机制，以寻找治疗乳腺炎的新靶点。
因此，我们假设SARA会诱导STIM1和ORAI1的表达上调，进而破坏细胞内Ca2?平衡，从而触发Hu羊乳腺组织中的炎症、自噬和细胞凋亡反应。
伦理声明
本动物实验获得了南京农业大学伦理委员会的批准，并遵循了该校的机构指南（协议编号NAJU.PZ2020102）。
实验设计与样本收集
选取12只平均体重为49.80 ± 5.00公斤的泌乳期Hu羊参与实验，随机分为两组（每组6只），分别喂食低浓度（LC，30%精料）或高浓度（HC，70%精料）日粮。
高浓度日粮激活SOCE通道
先前研究证实，高浓度日粮会导致Hu羊乳腺组织中Ca2?含量升高并引发SARA。SOCE通道是细胞内Ca2?流动的主要途径，因此本研究将重点探讨高浓度日粮对乳腺组织中SOCE通道的影响，评估饮食改变对STIM1和ORAI1表达及功能的影响。
讨论
亚急性瘤胃酸中毒（SARA）是反刍动物常见的代谢疾病，主要由瘤胃中挥发性脂肪酸的积累和瘤胃pH值下降引起。SARA不仅影响奶牛的健康，还会降低牛奶质量并造成经济损失。研究表明，高浓度日粮会降低奶牛和山羊的瘤胃pH值，引发SARA并导致乳腺和肝脏损伤[20,7]。我们通过喂食高浓度日粮成功诱导了Hu羊的SARA。
结论
综上所述，高浓度日粮通过上调STIM1和ORAI1的表达激活了SOCE通道，导致乳腺组织中Ca2?含量升高。升高的Ca2?水平通过上调CaMKKβ、NF-κB和AMPK-mTOR通路，引发炎症和自噬，最终导致Hu羊乳腺组织的细胞凋亡（见图8）。具体机制需进一步通过体外实验进行验证。
作者贡献
孟美娟和常光军负责实验的设计与实施。孟美娟构思并撰写了全文。任旭然、李学瑞和周善东负责实验操作和数据分析。常光军和沈向珍提供技术支持和材料保障。所有作者均审阅并批准了最终稿件。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（32503121）、中国博士后科学基金会（GZC20240717）和宁夏回族自治区自然科学基金（2022AAC02072）的资助。
数据与材料的可获取性
不适用
CRediT作者贡献声明
孟美娟：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法学设计，数据管理，概念构建。任旭然：方法学设计，数据管理。李学瑞：软件应用，方法学设计。周善东：软件应用，方法学设计。沈向珍：监督，方法学设计，实验实施。常光军：监督，方法学设计，资金争取，数据分析。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
