《Molecular Oncology》：Subtype-specific enhancer RNAs define transcriptional regulators and prognosis in breast cancers
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本研究运用机器学习算法，对乳腺癌患者的RNA测序（RNA-seq）数据进行分析，鉴定了具有分子亚型特异性和预后价值的增强子RNA（eRNA）。通过将亚型特异性eRNA与邻近共表达的mRNA关联，定义了关键调控网络（ProxCReAms），揭示了各亚型特有的关键转录因子（如核受体、FOX家族因子）和信号通路。该工作强调了基于eRNA的表达谱分析在识别乳腺癌上游调控网络、理解肿瘤异质性及评估患者预后方面的重要潜力。
引言：乳腺癌的异质性与增强子RNA的调控角色
乳腺癌是一种高度异质性的疾病，根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（Her2）的表达状态，可被划分为不同的分子亚型，如管腔A型（LumA）、管腔B型（LumB）、Her2型和基底样型。这些亚型在治疗反应和患者预后上存在显著差异，凸显了在分子水平上进行分层的必要性。基因表达受到称为增强子的顺式调控元件的精密控制，活跃的增强子会转录产生非编码RNA，即增强子RNA（eRNA）。eRNA的表达是转录因子活性的早期指标，并与癌症患者的治疗反应和生存期相关。尽管已有泛癌症研究鉴定出一些eRNA，但在高度异质的乳腺癌中，基于亚型对eRNA进行系统性分类及其功能关联的研究仍不充分。本研究旨在利用机器学习方法，从大量乳腺癌患者的RNA-seq数据中，鉴定亚型特异性和预后相关的eRNA，并探索其调控网络。
材料与方法：数据整合与机器学习分析框架
研究团队从TCGA eRNA图谱（TCeA）平台下载了1095个乳腺癌患者样本的eRNA表达数据集，这些数据基于Hnisz等人从H3K27ac染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据集中鉴定出的302,951个增强子位点。经过异常值过滤，最终975个肿瘤样本的数据用于后续分析。为了识别亚型特异性eRNA，研究采用了两种测量方法对eRNA表达的RPKM值进行处理：信息增益（InfoGain，基于k-means二值化）和对数均值中心化（Logmc，连续值）。随后使用随机森林（random forest）算法进行亚型分类，并评估分类效能。通过主成分分析（PCA）和UMAP进行降维可视化。此外，利用峰值集富集于基因集（PEGS）分析，将亚型特异性eRNA与同样通过InfoGain方法鉴定的亚型特异性mRNA进行关联，定义出邻近共表达调控性eRNA（ProxCReAm，即与mRNA相关联的邻近共表达调控eRNA）及其配对关系。研究还整合了Cistrome平台的转录因子ChIP-seq数据进行结合富集分析，利用TCGA-BRCA队列的ATAC-seq数据进行基序富集分析，并通过KAS-seq（酮氧辅助单链DNA测序）在MCF7细胞中验证增强子活性。生存分析采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验，并与已发表的Perturb-seq数据集进行整合，以验证eRNA的功能相关性。
结果
3.1 亚型特异性eRNA的鉴定
研究发现，基于InfoGain和Logmc两种测量方法，机器学习模型都能有效鉴定出乳腺癌的亚型特异性eRNA。其中，InfoGain方法鉴定了更多eRNA，并且其分类性能指标（如对基底样型的敏感性和对Her2型的精确度）略优于Logmc方法。PCA和UMAP可视化显示，基于eRNA的表达谱能够清晰区分基底样型和管腔型患者，但无法进一步区分LumA和LumB亚型。Her2型患者的eRNA表达谱介于管腔型和基底样型之间。有趣的是，无论采用哪种测量方法，均未能有效区分浸润性导管癌和小叶癌的组织学亚型。热图和层次聚类分析进一步显示，InfoGain方法鉴定的基底样型高表达eRNA在基底样型患者中高表达，在管腔型患者中低表达，反之亦然，形成了清晰的表达模式。相比之下，Logmc方法鉴定的eRNA表达模式更为混杂。因此，研究后续聚焦于InfoGain定义的eRNA进行深入分析。
3.2 定义邻近共表达的eRNA-mRNA对（ProxCReAms）
研究同时鉴定了亚型特异性mRNA。与eRNA相比，mRNA在区分LumA和LumB亚型上表现稍好。通过PEGS分析，将亚型特异性eRNA与其1 Mb基因组距离内的亚型特异性mRNA进行关联，定义了ProxCReAm eRNA-mRNA对。约81.45%的亚型特异性eRNA能以这种方式与mRNA关联。特别值得注意的是，尽管单独使用eRNA难以区分导管癌和小叶癌，但将低阈值下鉴定出的大量eRNA与mRNA关联后得到的ProxCReAm eRNA，能够更有效地区分这两种组织学亚型。与这些小叶癌特异性ProxCReAm对相关的mRNA富集了与染色体16q缺失（包含肿瘤抑制因子CDH1）、肿瘤外周区上调基因（与侵袭性相关）等通路，提示增强子重编程可能驱动了小叶癌的侵袭性和耐药性。
3.3 ProxCReAm eRNA与亚型特异性基因通路关联
通路富集分析表明，ProxCReAm eRNA所关联的mRNA显著富集于各亚型的特征性通路。例如，基底样型高表达eRNA关联的通路包括基底样特异性通路、Wnt/β-连环蛋白信号等；管腔A型eRNA关联的通路则富含ER靶基因和管腔上调通路；Her2型eRNA关联的通路涉及ERBB2扩增子相关基因。通过整合ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、CAGE和GRO-seq等多组学数据，验证了这些eRNA位点确实位于染色质开放、具有双向转录活性的活跃增强子区域。有趣的是，尽管这些区域活跃，但雌激素受体（ER）的结合位点并不完全与eRNA位点中心重合，有时相距250-1000 bp。对Her2基因座附近eRNA的三维基因组（Hi-C）分析显示，这些eRNA区域位于同一拓扑关联域（TAD）内，可能通过染色质环化共同调控ERBB2等关键基因。
3.4 亚型特异性eRNA与关键转录因子及表观遗传调控因子的关联
通过整合Cistrome的ChIP-seq数据，研究发现不同亚型的ProxCReAm eRNA位点显著富集了不同的转录因子和表观调控因子结合。基底样型高表达eRNA区域富集了TRIM28、H2AZ、EZH2、SPI1、MYB、CHD8等因子。管腔A型eRNA区域则显著富集了糖皮质激素受体（GR）、芳香烃受体（AHR）、染色质重塑复合物亚基SMARCA4、CREBBP、HIF1A以及FOXA2/FOXO1等forkhead结构域蛋白，但ER本身并不显著富集。Her2型eRNA区域富集了GR、HOXB7、ZNF384等因子。对eRNA侧翼可及染色质区域（ATAC-seq峰）的转录因子结合基序分析进一步支持了上述发现：管腔型区域富集FOX和Ets相关因子基序；基底样型区域富集RAR、AP1（Jun）、STAT、NF-κB等基序。为验证管腔型eRNA的ER非依赖性，研究在MCF7细胞中进行了KAS-seq实验，发现最强的单链DNA信号（代表活跃转录）和GRO-seq双向转录信号区域，其ER结合信号反而较弱，这支持了活跃的增强子转录不一定与ER直接结合的观点。
3.5 InfoGain衍生的eRNA具有预后价值
生存分析显示，管腔A型特异性eRNA高表达的患者总生存期更好，这与ER阳性患者预后较好的已知现象一致。基底样型和Her2型特异性eRNA的表达水平与患者总生存期无显著关联。然而，当专注于Her2亚型患者并根据其生存状态（存活vs.死亡）重新进行机器学习分类时，InfoGain方法鉴定出了一组342个预后相关的Her2 eRNA。这组eRNA的高表达与Her2患者较差的预后显著相关，其邻近基因富集于细胞粘附/连接通路，暗示了上皮-间质转化在不良预后中的作用。
3.6 亚型/预后特异性eRNA的功能验证
通过整合已发表的Perturb-seq数据（在ER+和ER-乳腺癌细胞系中进行CRISPRi增强子扰动后的单细胞RNA-seq），研究验证了部分鉴定出的eRNA的功能相关性。尽管重叠的增强子数量有限，但部分管腔A型和基底样型特异性eRNA所在的扰动增强子，确实能影响下游基因表达。这些基因富集于IL-2/STAT5信号、雌激素反应、TNF-α信号等与各亚型生物学特性相关的通路。例如，一个与LumB相关的扰动增强子可影响EMID1基因的表达，该基因促进细胞增殖和转移。
讨论
本研究强调了在异质性癌症中，先进行分子分型再鉴定生物标志物的重要性。机器学习方法，特别是基于二值化表达的InfoGain测量，能有效鉴定出具有亚型特异性和预后价值的eRNA。通过构建ProxCReAm eRNA-mRNA对，研究不仅将增强子活性与下游基因功能联系起来，还揭示了各亚型特有的上游转录调控网络。一个关键发现是，在管腔型乳腺癌的活跃增强子中，除ER外，其他核受体（如GR、AHR）和FOX家族先锋因子可能扮演更重要角色。此外，尽管传统RNA-seq主要捕获多聚腺苷酸化的转录本，但基于大量样本分析的eRNA信号仍足以揭示高活性的调控框架。研究也指出了当前基于polyA捕获的RNA-seq在探测不稳定eRNA方面的局限性，未来利用KAS-seq等新兴技术直接检测新生转录本将提供更全面的图谱。对浸润性小叶癌的分析表明，整合低表达阈值的eRNA与mRNA，能帮助解析其独特的侵袭性相关网络。最后，本研究鉴定的预后相关eRNA与先前泛癌症研究发现的eRNA重叠很少，进一步说明了分型研究的必要性。
结论
总而言之，本研究证明了在乳腺癌中，基于机器学习的eRNA表达谱分析能够鉴定出具有亚型特异性、预后价值及功能相关性的增强子-基因调控网络。这种方法为利用临床上易获取的RNA-seq数据，揭示肿瘤异质性背后的关键转录因子和表观遗传驱动因素，并开发潜在的预后生物标志物和治疗靶点，提供了新的途径。
