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这篇研究采用整合性分析框架，结合多位点系统发育（IQ-TREE2、STACEY）、DNA条形码（ASAP）与无监督机器学习（UML SuperSOM），重新界定了非洲藤蛇属（Thelotornis）的物种边界。结果显示该属应包含七个独立演化谱系，其中Xyelodontophis uluguruensis应归入Thelotornis，且原亚种T. capensis oatesi和T. c. capensis应提升为种级。研究揭示了该属在中新世中晚期（约16.6?Myr）起源，其多样化与非洲森林片段化、稀树草原扩张等历史生境动态密切相关，为理解非洲树栖蛇类的生态适应与隐存多样性提供了关键证据。
引言
非洲藤蛇属（Thelotornis）是分布在撒哈拉以南非洲的高度特化树栖游蛇，具有细长体型、隐蔽色和大而呈锁孔状或水平的瞳孔等适应特征。尽管形态保守，该属广泛分布于森林、林地和稀树草原等多种生境。长期以来，其物种边界和分类地位存在不确定性，尤其是单型属Xyelodontophis uluguruensis的归属问题。传统分类主要依据鳞片、体色、半阴茎形态等特征，但形态保守可能导致隐存物种未被识别。非洲自中新世以来的森林收缩、气候振荡和稀树草原扩张等历史景观动态，可能塑造了Thelotornis的谱系分化。本研究旨在通过整合遗传、形态、生态和空间数据，在统一物种概念（USC）框架下重新界定Thelotornis的物种边界，并探讨其多样化历史。
材料与方法
1. 样本与数据采集
内群样本涵盖当前公认的Thelotornis所有物种及亚种：T. c. capensis（n=11）、T. c. oatesi（n=8）、T. kirtlandii（n=10）、T. mossambicanus（n=9）、T. usambaricus（n=6）以及来自莫桑比克瓦米济岛（Vamizi Island）的一个未描述种群（T.sp.，n=3），并包括Xyelodontophis uluguruensis（n=3）。外群包括Dispholidini和Philothamnini部落的代表物种。样本组织与序列数据来自南非国家生物多样性研究所生物样本库、野外采集及GenBank。
2. 分子标记与测序
使用四个基因片段：两个线粒体蛋白编码基因（细胞色素b，cyt b；NADH脱氢酶亚基4，ND4）和两个核蛋白编码基因（c-mos和神经生长因子-3，NT3）。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增并测序。
3. 系统发育与多物种溯祖推断
使用最大似然法（IQ-TREE2）和多物种溯祖模型（STACEY）分别基于联合数据集（c-mos+NT3+cyt b+ND4）和线粒体数据集（cyt b+ND4）构建系统发育树。节点支持度通过超快自助法（UFBoot≥95%）和SH近似似然比检验（SH-aLRT≥80%）评估。利用STACEY进行物种树推断和分化时间估算，并使用化石和生物地理学信息标定时间。
4. 物种界定方法
采用多种互补方法界定物种边界：
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DNA条形码（ASAP）：基于线粒体基因（cyt b+ND4）的遗传距离自动划分物种。
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遗传距离与单倍型网络：计算cyt b和ND4的未校正平均成对序列分歧度，并构建cyt b的单倍型网络（POPART）以评估谱系内变异。
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溯祖物种界定分析（SDA）：基于STACEY输出，量化各谱系在后验分布中被稳定恢复为独立集群的概率。
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整合性无监督机器学习（UML SuperSOM）：将遗传数据、传统形态特征、空间坐标和生态属性（宏观生物群系和微生境）等多层数据整合，通过超级自组织映射（SuperSOM）进行聚类分析，确定最优物种簇数量（K=2–10）。
结果
1. 系统发育与多物种溯祖关系
最大似然树和溯祖物种树一致支持Thelotornis包含七个单系性得到强支持的进化谱系。Xyelodontophis uluguruensis嵌套于Thelotornis内部，使得Thelotornis仅在包含该物种时才构成单系群。七个谱系分别为：X. uluguruensis、T. kirtlandii、T. usambaricus、T.sp.、T. mossambicanus、T. c. capensis和T. c. oatesi。
2. 谱系分化时间
Thelotornis的干群年龄约为16.61?百万年（中新世中期）。属内多样化始于约8.25?百万年（晚中新世），分化为两个主要支系：
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一支为西-东非森林支系，包含T. kirtlandii和X. uluguruensis，局限于刚果森林带。
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另一支为东-南非支系，包含栖息地泛化种（T. usambaricus、T.sp.、T. mossambicanus、T. c. capensis）和稀树草原特化种T. c. oatesi。
东-南非支系内的后续分化依次发生：T. usambaricus（约5.54?百万年）、T.sp.（约4.51?百万年）、T. c. oatesi（约0.67?百万年），最近的分化是T. c. capensis与T. mossambicanus的分离（约0.42?百万年）。
3. 物种界定结果
所有分析方法均一致支持七个独立演化谱系：
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ASAP分析：基于线粒体位点的最佳划分方案识别出七个假定物种，条形码间隙（barcoding gap）为dT=3.4%。
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遗传距离：cyt b的未校正平均成对序列分歧度在谱系间为4.91%–12.37%，其中T. c. capensis与T. c. oatesi分歧度最低（4.91%），T. kirtlandii与其他谱系分歧度最高（>11.4%）。ND4数据结果类似。
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单倍型网络：cyt b单倍型网络显示，七个谱系各自拥有独特的单倍型，谱系间无共享单倍型，支持其独立的母系遗传历史。
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溯祖物种界定（SDA）：所有七个谱系在后验概率为1的条件下均被稳定恢复为独立集群。
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整合性UML SuperSOM分析：当聚类数K=7时，模型达到稳定，七个聚类与系统发育识别的谱系完全对应。各数据层对聚类的相对贡献分析表明，形态数据信号最强，其次为生物群系归属和DNA数据。
讨论
本研究首次提供了Thelotornis的多位点溯祖系统发育，整合证据强有力地支持该属包含七个物种。Thelotornis的多样化与非洲中新世中晚期以来的生境片段化（森林收缩、稀树草原扩张）和气候振荡在时间上吻合。西-东非森林支系（T. kirtlandii和X. uluguruensis）的长期隔离可能与东非弧形森林等避难所的持续存在有关。东-南非支系在早上新世（约5.5-4.5?百万年）的快速分化，则反映了祖先种群在沿海森林-稀树草原镶嵌体中生态泛化能力的演化，以及随后在构造活动、海平面变化和干旱化影响下的地理隔离。瓦米济岛种群（T.sp.）可能是在更新世海平面低位时通过陆桥从大陆殖民而来。最年轻的三个谱系（T. mossambicanus、T. c. capensis、T. c. oatesi）在约0.67-0.42?百万年前的晚更新世分化，可能与C4草原生态系统的最终确立及生态位特化（沿海灌丛、稀树草原）相关，其间观察到的低遗传分歧和可能的谱系不完全分选（ILS）信号，符合年轻谱系在生态过渡带逐渐分化的预期。
与许多游蛇类群不同，Thelotornis的形态差异（如头部鳞片模式和体色）与系统发育关系有良好的对应，这可能与其树栖生活史相关的功能适应有关。生态位分析进一步明确了各物种的生境偏好，纠正了以往一些分布误判（如T. kirtlandii可能仅限于阿尔伯特裂谷以东的低地森林）。
分类学修订
基于整合分析的所有证据，在统一物种概念（USC）框架下，本研究对Thelotornis分类提出以下修订：
- 1.
Thelotornis为单系群，但需包含Xyelodontophis uluguruensis。后者应重新归类为Thelotornis uluguruensiscomb. nov.。
- 2.
原T. capensis的两个亚种应提升为独立物种：Thelotornis capensis和Thelotornis oatesistat. nov.。
- 3.
承认T. kirtlandii、T. usambaricus、T. mossambicanus以及来自瓦米济岛的未描述物种（T.sp.）的独立物种地位。
- 4.
据此修订Thelotornis的属征，纳入圆形瞳孔以及具有锋利前后缘、基部狭窄的强烈弯曲后上颌齿等特征（以T. uluguruensis为例）。
综上，本研究通过整合多学科证据，解决了Thelotornis长期存在的分类不确定性，揭示了其隐存多样性，并阐明了非洲历史景观动态在塑造树栖蛇类辐射演化中的关键作用。
