《Materials Today Bio》：Biomimetic sequentially gated nanotuners based on amorphous metal–organic frameworks for reprogramming the metabolism-ferroptosis-immunity crosstalk in gliomas
编辑推荐：
本文介绍了一种新型的CRISPR/Cas9工程人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肺类器官平台，其内源性表达G3BP1–mCherry融合蛋白。该平台实现了在毒物暴露下对细胞应激颗粒（SG）形成的实时、无损可视化监测。研究表明，类器官模型比传统的2D或肿瘤衍生模型对毒性更敏感，且SG的动态变化与上皮屏障完整性的破坏相关，可作为毒性诱导细胞应激的早期指标。该工作整合了高内涵筛选技术，为评估肺毒性提供了一种预测性和机制性更强的新方法（NAM）。
在人类呼吸健康领域，如何准确、早期地评估化学物质的肺部毒性一直是个巨大的挑战。从日常使用的消毒剂、防腐剂，到工业生产中释放的化学物质，持续不断地通过空气、水和各种产品进入人体，与一系列严重的肺部疾病相关，如上皮损伤、纤维化和慢性呼吸功能障碍。然而，传统的毒性评估方法存在明显局限。它们通常依赖于二维培养的永生化细胞系，这些细胞缺乏人体肺组织复杂的细胞多样性和三维结构，难以真实模拟生理环境。更重要的是，常规方法主要测量细胞凋亡、活性氧生成或活力丧失等晚期结局，这些指标往往反映的是不可逆的细胞损伤，而无法捕捉到那些在细胞明显死亡前发生的、短暂且可逆的早期应激反应。这就好比是等房子塌了才去检查结构问题，为时已晚。为了填补这一空白，科学界急需一种能够模拟人类肺部生理、并能实时监测早期应激信号的先进体外模型。
正是在这样的背景下，一项发表于《Materials Today Bio》的研究带来了突破。该研究旨在开发一种新型的、更具预测性的肺毒性评估平台。为了实现这个目标，研究人员巧妙地融合了前沿的生物技术。他们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，将一个荧光蛋白mCherry的标签精准地插入到人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）的内源性G3BP1基因位点，从而构建了一个内源性表达G3BP1–mCherry融合蛋白的hiPSC系。G3BP1是应激颗粒（Stress Granule, SG）——一种在细胞遭遇压力时形成的临时性核糖核蛋白凝聚体——的关键成核蛋白。通过这种基因打靶策略，荧光信号能随着内源性G3BP1的表达而自然呈现，避免了过表达带来的假象。随后，研究人员将这种工程化的干细胞一步步诱导分化为三维的、具有复杂细胞组成的人肺类器官（human lung organoids, hLOs）。最终，他们将这个能实时“发光”报告应激状态的干细胞系，与能模拟人体肺部复杂结构的类器官技术相结合，创造出了一个革命性的平台。这个平台的核心在于，能够在不破坏样本的情况下，通过荧光显微镜活体、实时地观察当肺类器官暴露于有毒化学物质时，细胞内部应激颗粒（SG）是如何快速形成、变化甚至消失的。这为在细胞受到不可逆伤害之前，就捕捉到最早期的“求救信号”提供了可能。该研究还整合了高内涵筛选（high-content screening, HCS）技术，实现了对大量细胞样本中SG动态的自动化、定量化分析，极大地提升了通量和可重复性。这不仅仅是观察工具的升级，更是一种毒性评估范式的转变，为迈向基于人类生理相关模型的新方法（New Approach Methodology, NAM）铺平了道路。
在技术方法层面，作者主要运用了以下几项关键技术：1) CRISPR/Cas9介导的内源性基因敲入：构建了稳定表达G3BP1–mCherry融合蛋白的hiPSC系。2) 人诱导多能干细胞向肺类器官的分化与成熟：通过多阶段的细胞因子诱导，将hiPSC分化为包含气道和肺泡上皮细胞类型的3D肺类器官，并优化了悬浮培养和表观遗传调节剂（5-aza-dC）的使用以促进成熟。3) 高内涵活细胞成像：利用自动化成像系统对暴露于不同毒物的类器官进行长时间、多时间点的荧光成像，定量分析SG的形成与动力学。4) 单细胞RNA测序：对分化后的类器官进行单细胞转录组分析，以全面解析其细胞组成和谱系特征。研究中使用的hiPSC系（CMC-hiPSC-009）来自韩国国家干细胞库，患者来源的肺癌类器官（LCO）系SNU-2689-CO则来自韩国细胞系库。
3.1. CRISPR/Cas9介导的内源性G3BP1–mCherry敲入hiPSC系的构建与验证
研究人员首先利用CRISPR/Cas9技术，成功将mCherry荧光蛋白标签精准融合到hiPSC内源性G3BP1基因的C末端。通过基因分型PCR、Sanger测序和蛋白质印迹分析，证实了敲入的正确性以及G3BP1–mCherry融合蛋白的表达。更重要的是，当细胞暴露于经典的SG诱导剂亚砷酸钠时，原本弥散的mCherry荧光迅速凝聚成明显的点状结构，证实了该报告系统能有效、实时地可视化应激颗粒的形成。此外，该敲入细胞系保持了正常的核型、多能性标志物的表达以及向三个胚层分化的能力，证明基因编辑没有损害干细胞的基本特性。这为后续构建功能性的肺类器官报告系统奠定了坚实基础。
3.2. G3BP1–mCherry hiPSC向肺类器官的分化及成熟条件的优化
研究人员成功地将工程化的hiPSC逐步分化为肺类器官。为了获得更成熟、更接近生理状态的肺上皮，他们比较了两种成熟培养基：DCIF10（含地塞米松、cAMP、IBMX和FGF10）和在DCIF10基础上添加了DNA去甲基化剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-dC）的DCIF10A。研究发现，在悬浮培养条件下，使用DCIF10A培养基能更有效地促进类器官的成熟。透射电镜观察到了类器官细胞内存在板层小体样结构，这是肺泡II型上皮细胞的典型特征。基因和蛋白水平分析也证实，成熟的类器官中同时表达了气道基底细胞、杯状细胞、克拉拉细胞、纤毛细胞以及肺泡I型和II型上皮细胞的标志物。这表明优化后的培养体系成功诱导出了具有高度细胞多样性的肺上皮组织。
3.3. 单细胞RNA测序揭示人肺类器官中气道和肺泡上皮的重建
为了精确解析类器官的细胞组成，研究人员进行了单细胞RNA测序分析。结果在肺类器官的上皮细胞中鉴定出了7个不同的细胞群体：基底细胞、KRT5-/KRT17+过渡细胞、分泌细胞、杯状细胞、肺泡样上皮细胞、增殖细胞和神经内分泌细胞。其中分泌细胞占比最高。标志基因表达谱支持了这些细胞类型的注释。进一步的发育成熟度基准分析显示，该类器官的转录组特征与胎儿肺组织更为接近，表明其处于一个器官样但发育上相对未成熟的状态。这一定量分析从转录组层面证实了该肺类器官模型成功重建了人类肺上皮的细胞复杂性。
3.4. G3BP1–mCherry肺类器官中应激颗粒动力学的实时可视化
研究最核心的部分是验证该平台实时监测SG动态的能力。活细胞成像显示，当肺类器官暴露于亚砷酸钠时，细胞质中的G3BP1–mCherry信号在10-20分钟内就从弥散状态快速凝聚成离散的点状SG，并在约30分钟达到峰值，随后开始减少，展现了SG形成的快速性和可逆性。这种响应具有剂量和时间依赖性。不仅如此，对于作用机制不同的其他毒物，如膜活性杀菌剂苯扎氯铵（BAC）和亲电性防腐剂苯并异噻唑啉酮（BIT），该报告系统同样能检测到SG的形成。这证明G3BP1–mCherry肺类器官平台能够广谱、敏感地检测由不同化学物质引发的早期细胞应激。
3.5. 肺类器官与传统模型在毒物敏感性上的差异
为了评估新模型的预测价值，研究人员比较了工程化肺类器官、A549肺癌细胞（2D和3D球体）以及患者来源的肺癌类器官对不同毒物的敏感性。细胞活力测定结果显示，对于测试的所有代表性毒物（如DDAC、OIT、PHMG-p、4,4’-MDI和丙烯腈），hiPSC来源的肺类器官的IC50值均显著低于A549细胞，表明其对化学诱导的细胞毒性更为敏感。在包括A549球体、肺癌类器官和肺类器官的3D模型横向比较中，肺类器官对亚砷酸钠、BAC和BIT也 consistently表现出最高的敏感性（最低的IC50）。进一步的免疫荧光分析发现，在亚砷酸钠暴露下，肺类器官中SG形成的剂量阈值低于肿瘤来源的肺癌类器官。这些结果共同表明，源自正常干细胞的肺类器官比永生化或癌变的细胞模型能更早、更敏感地捕捉到化学应激信号，更能代表正常人体肺组织对毒物的反应。
3.6. 应激颗粒动力学与暴露时间依赖性的上皮屏障完整性相关
最后，研究探讨了SG这一早期信号与更终端的组织功能损伤——上皮屏障完整性之间的关系。活细胞成像显示，SG在毒物暴露期间迅速组装，在毒物移除后逐渐解离。免疫荧光分析紧密连接蛋白ZO-1发现，短期暴露（1小时）后给予恢复期，上皮屏障结构基本得以保持；而持续高剂量暴露（3小时）则会导致ZO-1连接组织的明显破坏。重要的是，在两种暴露条件下，SG都在早期被强烈诱导，但只有持续暴露导致了明显的屏障损伤。这表明SG的形成是一个先于明显上皮损伤的早期事件。这一发现将分子水平的早期应激适应与组织层面的功能响应联系了起来，支持将SG成像作为预测潜在组织损伤的早期、灵敏的生物标志物。
在结论和讨论部分，该研究强调，所构建的G3BP1–mCherry hiPSC肺类器官平台成功地将内源性SG报告基因、人类生理相关的3D肺组织模型以及高内涵活细胞成像技术融为一体。这一平台的核心意义在于它能够实时、无损地可视化并定量分析化学毒物暴露下最早的细胞应激反应之一——应激颗粒的动力学。这克服了传统毒性检测方法只能捕获晚期、不可逆损伤事件的局限。该肺类器官模型重现了人类肺上皮的细胞多样性和组织结构，其对毒物的敏感性高于永生化或肿瘤细胞模型，预测价值更高。研究还揭示了SG动态与暴露时间依赖性的上皮功能损伤之间的关联，为区分可逆的适应性应激和可能导致组织损伤的有害暴露提供了新的视角。综上所述，这项工作不仅为肺部毒性评估提供了一种强大、敏感且具有预测性的新方法（NAM），其内源报告基因策略和hiPSC的可分化多能性，也为将该平台扩展至其他器官的毒性评估和更广泛的化学安全评价奠定了基础。
