编辑推荐：
本文聚焦于植物生长素（auxin）代谢与胁迫适应的交叉前沿，通过鉴定并系统研究黄瓜（Cucumis sativus L.）中的一个新型SABATH家族成员——CsIAMT，揭示了其作为保守的生长素甲基转移酶（IAMT）的核心功能。研究从进化、结构、功能验证到表达谱分析，完整描绘了CsIAMT在调控生长素内稳态（通过催化IAA向MeIAA转化）及响应逆境（特别是生物胁迫）中的分子图景，为深入理解植物激素代谢通路在适应复杂环境中的调控网络提供了新视角。
引言与研究背景
气候变化作为一种强大的选择压力，驱动着植物种群的生态和进化响应，对农业系统和自然生态系统构成重大威胁。在这种背景下，理解植物适应复合胁迫的分子机制，对于制定旨在增强气候适应性的作物育种策略至关重要。植物生长素，主要是吲哚-3-乙酸(IAA)，是生长和发育过程的核心调节剂，其活性不仅通过生物合成、运输和降解进行微调，也通过化学修饰如甲基化来实现。IAA向其甲酯(MeIAA)的转化是一个关键的调节节点，影响着生长素的稳态、稳定性和信号传导。该反应由生长素甲基转移酶(IAMT)催化，该酶是植物SABATH基因家族的古老成员之一。尽管IAMT在多种植物谱系中进化保守，但其在黄瓜(Cucumis sativus L.)生态适应中的功能贡献，特别是在协调生物与非生物复合胁迫下的权衡机制，在很大程度上仍未得到充分探索。
1.1 CsIAMT基因的鉴定与系统发育分析
为了鉴定黄瓜SABATH家族中潜在的IAMT基因，研究基于拟南芥、水稻、番茄和黄瓜的SABATH蛋白序列，采用最大似然法构建了系统发育树。结果显示，AtIAMT和OsIAMT聚集在A组的一个亚支内，该亚支中的两个番茄基因与先前报道的番茄SABATH家族成员鉴定结果一致。值得注意的是，黄瓜基因CsaV3_7G020980是该亚支中存在的唯一黄瓜成员。序列相似性方面，使用AtIAMT蛋白序列对葫芦科基因组数据库进行Blastp搜索，获得了五个同源基因，其中CsaV3_7G020980与AtIAMT的相似性最高，超过70%。进一步对这五个候选基因与其他物种的SABATH家族成员进行系统发育分析，发现所有不同物种的IAMT蛋白都聚集在一个独立的单系分支内，而只有黄瓜的CsaV3_7G020980与该分支中其他物种的IAMT蛋白共聚，这与图1a的结果一致。保守基序分析表明，不同物种SABATH家族成员的基序组成高度相似，特别是CsaV3_7G020980的保守基序模式与其他物种的IAMT蛋白几乎完全相同。系统发育关系分析进一步表明，CsaV3_7G020980与莲的关系最密切，其次是杨树。对黄瓜与其他物种基因组共线性的比较分析发现，黄瓜仅与拟南芥存在保守的共线性区域，在这些区域内，黄瓜基因CsaV3_7G020980与拟南芥的AtIAMT存在共线性关系。综合系统发育聚类、保守基序分析、序列相似性和共线性关系的证据，研究将CsaV3_7G020980鉴定为黄瓜中一个进化上保守的生长素甲基转移酶，并将其命名为CsIAMT。进化分析表明，CsIAMT及其直系同源物在其分化过程中一直承受着强烈的纯化选择。尽管同义替换率(dS)较高（大多数比较中dS > 1.0），表明存在古老的基因复制事件，但非同义替换率与同义替换率的比值(dN/dS, ω)始终显著小于1。具体而言，黄瓜CsIAMT与AtIAMT1之间的ω值为0.14，而与水稻和杨树直系同源物的比较得出的值分别为0.24和0.16。这些极低的ω值表明存在强大的功能约束，在漫长的进化时间内保留了IAMT酶活性所必需的关键氨基酸序列。
1.2 序列比对与结构表征
CsaV3_7G020980位于黄瓜7号染色体上，编码一个由385个氨基酸组成的蛋白序列，其长度与其他物种的IAMT大致相同。与其他物种的IAMT一样，CsaV3_7G020980也包含三个内含子和四个外显子。为了验证CsaV3_7G020980是否为CsIAMT，研究选择了AtIAMT、LjIAMT、PtIAMT、OsIAMT和CbSAMT的蛋白序列进行比对。CbSAMT中的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点已被识别。如图2a所示，CsaV3_7G020980中SAM结合位点的氨基酸与CbSAMT中SAM结合位点的氨基酸相似。在CbSAMT中，Trp226是形成水杨酸结合位点的氨基酸之一。而在AtIAMT、LjIAMT、PtIAMT和OsIAMT中，Trp226残基被Gly残基取代，这为识别和结合IAA的吲哚环创造了一个大而宽敞的口袋。在CsaV3_7G020980中，该位点也发生了相同的取代。这不仅为证明该位点在与IAA结合中的重要性提供了更充分的证据，而且基于其结构与已知IAMT的保守性，将基因CsaV3_7G020980命名为CsIAMT。随后，研究进一步基于黄瓜及各物种IAMT的蛋白序列预测了蛋白质的三维结构。同时，拉氏图表明该模型的构象是合理的。如图2b所示，尽管物种不同，IAMT的三维结构大多相似，其突变位点支架分为两类。CsIAMT、AtIAMT和PtIAMT属于一类，而OsIAMT、LjIAMTa和LjIAMTb属于另一类。
1.3 CsIAMT在黄瓜中的功能验证与表达模式
为了进一步验证该基因是否编码黄瓜中的IAMT蛋白，研究用一组潜在底物处理植株，包括IAA、苯甲酸(BA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)和生长素类似物吲哚-3-丁酸(IBA)。结果显示，CsaV3_7G020980对各种激素刺激表现出显著不同的响应模式。值得注意的是，外源IAA处理在6小时诱导CsaV3_7G020980表达量急剧上调数百倍，远超任何其他激素处理引起的变化幅度。相比之下，用BA、SA和GA处理的植株中，CsaV3_7G020980表达量的变化保持在几倍范围内。到12小时，除SA处理下有约7倍的上调外，大多数其他处理的变化不显著。虽然IBA也能在一定程度上调节CsaV3_7G020980的表达，但其诱导水平相对较低。这些结果表明，IAA在激活CsaV3_7G020980方面具有显著的专一性和效率，意味着该基因主要在IAA作为底物时才被特异性激活，而BA、SA和GA缺乏类似的诱导能力。因此，研究将CsaV3_7G020980命名为CsIAMT。
为了进一步阐明CsIAMT表达变化与激素代谢之间的关系，研究在激素处理12小时后使用液相色谱法测定了植株内源IAA及其甲酯(MeIAA)的水平。在IAA处理组中，不仅外源施加的IAA被迅速转化和吸收，内源IAA和MeIAA的含量也在所有处理中达到最高水平。IAA和MeIAA的显著积累表明，外源IAA的引入不仅直接提供底物，还可能激活CsIAMT的表达，从而驱动内源IAA向MeIAA的甲基化转化。相比之下，在其他激素处理下，尽管CsIAMT表达水平有所波动，但未检测到与IAA处理下观察到的IAA/MeIAA代谢物浓度相当的变化。
综上所述，本研究证实IAA是CsIAMT基因最有效和特异性的转录诱导剂，其上调表达与内源IAA和MeIAA水平的显著增加密切相关。这种特异性调控模式表明，CsIAMT编码的蛋白在黄瓜中主要作为IAA甲基转移酶发挥作用，直接参与维持生长素，特别是其活性形式IAA及其甲基化形式MeIAA的代谢稳态。其他激素对CsIAMT表达的调控作用相对较弱，可能反映了植物激素信号网络内复杂的交叉互作，而非这些激素直接作为甲基化反应的供体。
此外，本研究分析了CsIAMT在叶片动态发育和幼嫩器官中的表达模式。在三叶期不同时间点叶片以及同期植株的幼嫩和成熟叶片的qRT-PCR检测显示，当第三片叶刚刚展开时(第14天)，CsIAMT的表达丰度显著高于完全成熟时(第28天)，差异达数十倍。同时，在同一时间点(浇水后0和6小时)对单叶期和三叶期植株的取样分析表明，无论处理如何，幼嫩叶片中CsIAMT的表达量均显著高于同一时间从同一植株采集的成熟叶片。这些结果表明，CsIAMT可能优先参与叶片早期扩展或分化过程中的生长素代谢调节。研究组先前的研究也表明，CsIAMT在根、叶、雄蕊、雌蕊、卷须和幼果中均有表达，尤其在幼果中表达水平显著更高。研究进一步验证了CsIAMT在幼果中的表达，发现其转录水平比根组织高数十倍，表明该基因可能在器官发育中发挥重要的调控作用。总之，推测CsIAMT在黄瓜中的表达表现出显著的发育阶段特异性；它在活跃生长的组织或器官中高表达，其表达水平随着组织的成熟而逐渐降低。
1.4 转基因烟草中验证CsIAMT作为IAA甲基转移酶的功能
为了验证预测的CsIAMTIAA甲基转移酶活性，研究在烟草中进行了异源表达。蛋白质印迹分析证实了CsIAMT蛋白在转基因株系中的成功积累。随后的代谢物分析显示，这些过表达植株发生了显著的代谢转变：IAA含量从野生型的0.45 mg/mL降至0.19 mg/mL（减少约57%），而MeIAA含量则从3.1 mg/mL显著增加至10.9 mg/mL（增加了3.5倍）。这种底物(IAA)的互补性减少和产物(MeIAA)的积累，为CsIAMT催化IAA甲基化为MeIAA提供了直接的体内证据，证实了其作为IAA甲基转移酶的功能。
1.5 CsIAMT响应多种胁迫的表达谱分析
为了阐明CsIAMT在各种环境挑战下的表达模式，研究分析了其在黄瓜八个不同的RNA-seq数据集中的转录水平，这些数据集涵盖了非生物和生物胁迫。通过全局中值缩放方法对所有样本的基因表达值进行归一化，以实现跨实验的直接比较。CsIAMT在不同的胁迫条件下表现出动态但独特的调控模式。在非生物胁迫下，该基因以胁迫特异性的方式作出响应。高温处理引发了强烈的、时间依赖性的诱导，表达在6小时达到峰值。相比之下，低温导致渐进性下调，在12小时达到最低水平。渍水胁迫导致7天后CsIAMT表达显著抑制。同时，盐胁迫仅引起其转录丰度的微小变化。对生物胁迫的响应揭示了更复杂的时间动态。在根结线虫侵染后，CsIAMT的表达在早期时间点(1天)受到抑制，但随后被强烈诱导，在侵染后2天和3天表现出高表达水平。在霜霉病侵染期间也观察到了类似的模式，表达在早期阶段较低，但到第6天大幅增加。白粉病侵染持续上调了CsIAMT的表达。相反，角斑病菌的侵染导致CsIAMT的显著下调，在侵染后1天和3天观察到相似的低表达水平。总之，CsIAMT受到多种胁迫的差异性调控。它被高温和特定病原体侵染显著诱导，但被低温、渍水和角斑病抑制。诱导幅度，特别是在白粉病和线虫侵染等生物胁迫的后期阶段，通常超过在非生物挑战下观察到的幅度。这种基于转录组的综合分析，强调了CsIAMT在黄瓜响应生物胁迫中的重要作用，突显了其在植物防御信号传导中的潜在重要性。
讨论与结论
黄瓜是一种全球重要的蔬菜作物，在气候变化的背景下，面临着干旱、高温等非生物胁迫以及病原体爆发等生物胁迫日益增加的压力。在此生态和进化框架下，解析和利用关键的遗传调控模块以增强作物在波动环境中的适应性和恢复力，对于农业系统的可持续性至关重要。SABATH基因家族代表了植物化学多样化的进化保守系统，而IAMT是其最古老的成员之一。系统发育分析表明，跨物种的IAMT直系同源物具有共同起源，并形成了一个得到良好支持的单系进化支。强烈的纯化选择信号(dN/dS < 1)和保守的微观共线性，特别是黄瓜和拟南芥之间的共线性，突显了该基因谱系在进化时间内的功能保存。为了验证其预测功能，CsaV3_7G020980在烟草中进行了异源表达。在转基因过表达株系中，观察到IAA含量下降，而MeIAA显著增加，支持了其被鉴定为CsIAMT，并证实了其IAA甲基转移酶活性。此外，qRT-PCR分析显示，CsIAMT在幼果和新发育的叶片中表达尤其高，这些组织是生长素合成和分布的关键部位。这种时空表达模式表明，CsIAMT可能通过将IAA甲基化为MeIAA来微调活性生长素水平，从而有助于调节的器官发育。叶片成熟过程中CsIAMT表达的减弱，进一步与其协调发育转变的假定功能一致。
除发育外，生长素信号传导与胁迫响应密切相关。基于先前发表的数据和本研究的转录组分析，CsIAMT可被生物和非生物胁迫诱导。然而，其诱导水平在生物胁迫下更为显著，这可能暗示其在黄瓜抗病通路中的特定作用。病原菌可以通过操纵宿主植物的生长素信号通路来促进侵染。CsIAMT的上调可能代表了宿主的一种反制策略，其潜在机制可能包括降低生物活性生长素水平以限制病原菌的利用，或生成MeIAA作为一种防御信号，该信号可能与水杨酸(SA)介导的抗性相互作用。
尽管本研究为CsIAMT的进化保守性、胁迫响应性表达和催化功能提供了分子证据，但其精确的生态和进化意义需要谨慎解读。在强烈纯化选择的背景下，观察到的CsIAMT在生物胁迫下更强的诱导，暗示这个保守的生化模块可能被征召用于防御响应中的特定角色。从进化角度看，IAMT在植物谱系中的保守性，加上其对IAA的底物特异性，意味着通过甲基化微调生长素稳态可能代表了在病原压力下的一种适应性机制。在功能上，病原体挑战后CsIAMT的快速上调可以调节游离IAA水平，从而限制病原菌对生长素信号传导的操纵，而产生的MeIAA可能作为一种防御代谢物或信号。
总而言之，本研究从Blastp分析、系统发育关系、序列比对、外源激素处理、组织特异性表达谱分析，到胁迫响应转录组数据挖掘，完整地定义CsIAMT为生长素代谢中一个进化保守的组分，它被整合到胁迫响应网络中，并可能有助于在生物压力下的适应性调节。该研究为后续通过改良CsIAMT来增强黄瓜抗逆性的研究奠定了基础。
