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本文为极度濒危物种非洲斑嘴环企鹅（Spheniscus demersus）的野外种群保护管理提供了创新且关键的监测工具。研究针对传统性别鉴定方法（如血液采样）在野生个体应用中的困难，成功优化了从富含抑制剂粪便（guano）和难以裂解脱落羽毛中提取DNA的方法，并结合针对CHD1染色体上CHD1-Z/W基因（Chromobox-helicase DNA-binding gene）的PCR（Polymerase Chain Reaction）引物集，实现了无创、准确的遗传性别鉴定。此方法尤其适用于性成熟前幼鸟的性别确定，有助于获取对保护管理至关重要的种群性别比数据。
1 Introduction
非洲斑嘴环企鹅（Spheniscus demersus）自1984年被世界自然保护联盟（IUCN）列入易危物种名录以来，野生种群数量持续下降，至2024年已被提升为极度濒危状态，预计繁殖对数量已低于10,000对，该物种可能在未来十余年内面临灭绝。种群下降与栖息地破坏、过度捕捞和寄生虫感染等多种环境及人为压力相关。准确的种群性别比数据对于理解种群动态、繁殖率、亲代抚育角色、遗传多样性及整体种群稳定性与恢复至关重要，然而，野外非洲斑嘴环企鹅的性别鉴定却十分困难。该物种仅表现出轻微的外部性二态性（如喙和体型差异），且形态测量范围在雌雄间存在重叠，导致其不可靠。而基于雌激素与睾酮比值的类固醇性别鉴定法，对性成熟前个体和繁殖期动物同样不可靠。目前，活体性别鉴定主要依靠腹腔镜检查和泄殖腔检查，或通过侵入性的血液或组织样本进行遗传检测，这些方法在获取上存在固有困难，且可能对野生动物造成应激和伤害。尽管已有研究利用鸟类粪便对多种物种（包括其他企鹅物种）进行遗传性别鉴定，也有研究利用羽毛（包括洪堡企鹅）进行类似工作，但这些方法尚未在非洲斑嘴环企鹅中得到验证，且部分研究使用拔取的羽毛，其伦理问题与血液采样类似。本研究旨在优化基于非侵入性粪便和自然脱落羽毛样本的DNA提取与PCR遗传性别鉴定方法，以期为该极度濒危物种的野外保护监测提供有力工具。
2 Methods
2.1 Sample Collection
样本采集自美国康涅狄格州神秘水族馆（Mystic Aquarium）人工饲养下的非洲斑嘴环企鹅个体。样本包括粪便、脱落羽毛以及作为阳性对照的血液。粪便样本采用无菌拭子采集，并优先选择肉眼可见粪便（固态、绿色）比例高于尿酸盐（液态、黄色）的样本，以降低尿酸盐（一种已知PCR抑制剂）的影响。脱落羽毛在换羽期非侵入性收集。血液样本则通过兽医检查获取。所有样本均标注动物ID和日期，并按规定条件保存。
2.2 DNA Extraction
DNA提取在无PCR产物的区域进行。粪便和羽毛样本均设置重复。粪便样本经过预处理（包括在55°C水浴中长时间孵育并添加蛋白酶K）后，使用QIAamp DNA Stool Mini试剂盒（针对富含抑制剂的粪便优化）进行提取，并减少了除InhibitEx试剂外的所有体积。脱落羽毛样本的羽根部分被剪碎，使用添加了蛋白酶K和DTT（二硫苏糖醇）的裂解缓冲液在55°C水浴中孵育24-48小时，然后使用DNeasy Blood & Tissue Kit进行提取。血液样本使用同一试剂盒提取，但延长了孵育时间。所有提取均使用减少的最终洗脱体积以提高DNA浓度。
2.3 PCR Amplification
PCR反应使用两种引物组：CHD1F/R和2550F/2718R，它们靶向CHD1性别染色体上CHD1-Z和CHD1-W基因的性别特异性长度多态性。反应体系包含DreamTaq PCR Master Mix、引物、DNA模板和ddH2O。PCR程序包括预变性、梯度降落PCR循环和延伸循环。PCR产物通过2.5%琼脂糖凝胶电泳在1X TBE缓冲液中80V电泳60分钟进行可视化。阳性扩增条带从凝胶中切出、纯化并送Sanger测序验证。
3 Results
粪便和血液样本的PCR扩增成功率为100%，而脱落羽毛样本的成功率约为87%-88%（有三个样本未显示条带），且条带亮度不一。失败与样本存档时间无关，因为最老的样本（约4年）也显示阳性条带。使用CHD1引物，通过凝胶电泳可鉴定性别：雌性显示515 bp（CHD1-Z）和600 bp（CHD1-W）两条带，而雄性仅显示一条515 bp（CHD1-Z）条带。2550F/2718R引物同样显示出可见差异：雌性有615 bp和700 bp两条带，雄性仅有一条415 bp的条带。对两只雏鸟（5-8周龄）的粪便样本进行测试，成功地在临床血液检测确认前准确鉴定了其性别。CHD1 Z和W基因扩增产物的最近序列匹配结果显示，与GenBank上麦哲伦企鹅（Spheniscus magellanicus）的CHD1 Z和W基因序列分别有97%和83%的相似性。
4 Discussion
对极度濒危的非洲斑嘴环企鹅野生种群进行更深入的人口统计学和生态学监测至关重要，而性别鉴定数据对于评估繁殖稳定性和制定保护管理策略非常有用。本研究验证的非侵入性粪便和脱落羽毛样本PCR遗传性别鉴定技术，为从野生种群获取这些数据提供了有前景的工具，避免了目前限制样本量的侵入性血液检测。本研究的一个主要障碍是从粪便和脱落羽毛中提取DNA。与大多数动物的纯粪便不同，鸟类粪便还含有尿酸盐，这是一种已知的PCR抑制剂。本文的提取方法经过专门修饰以减少其抑制作用，包括延长孵育时间和使用专为去除PCR抑制剂设计的商业提取试剂盒。脱落羽毛样本同样难以提取DNA，因为其中含有较少且活性较低的DNA，并且DNA常随时间降解，包裹在角质鞘中难以裂解。使用DTT和延长消化裂解时间被证明是充分提取DNA的关键。尽管对所有年龄的鸟类都适用，但粪便性别鉴定方法的灵敏度与准确性对非洲斑嘴环企鹅雏鸟可能尤为重要。雏鸟性别鉴定的一个主要问题是，需要数月时间才能安全地对其进行保定以采集血液样本，而粪便样本可以在其孵化后第一次排便时即被非侵入性采集和分析。尽管在野外巢区收集雏鸟粪便样本存在交叉污染以及雏鸟粪便中尿酸盐比例更高等固有难题，但随着野外康复中心人工育雏实践的增多，此方法可能在放归前收集性别数据方面发挥效用。利用脱落羽毛进行性别鉴定对存档的时间序列样本可能具有特殊价值，因为长达4年的样本仍能产出足够DNA进行扩增和电泳可视化。对于与野生个体打交道的康复中心，这些样本也易于储存。然而，在真正的野生群落中使用脱落羽毛研究个体存在固有困难，即在环境中收集脱落的羽毛并将其归属到单一个体在操作上不切实际。一个适当的应用方式可能是从定期进入康复中心的换羽期个体身上收集羽毛。总体而言，与脱落羽毛相比，目前利用粪便样本进行遗传性别鉴定似乎是更可靠、后勤上更可行的非侵入性样本来源。最终，本研究验证的PCR遗传性别鉴定技术，首次为非洲斑嘴环企鹅提供了一种完全非侵入性、准确可靠的性别鉴定方法。这些方法的使用为野生个体的种群统计学监测提供了实用工具，从而有助于为这一极度濒危物种的保护提供信息依据。
