《Environmental Microbiology Reports》：Relative Humidity Influences Aureobasidium pullulans Degradation of Polyester Polyurethane Foam
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本文探讨了环境相对湿度（Equilibrium Relative Humidity, ERH）对植物病原真菌Aureobasidium pullulans降解聚酯型聚氨酯（Polyester Polyurethane, PU）泡沫的影响。研究通过重量损失、扫描电子显微镜（SEM）成像、转录组测序（RNA-seq）和Impranil酶解试验证实，高ERH（85%和100%）显著增强了PU泡沫的降解程度，并上调了角质酶（Cutinase）等降解相关基因的表达，为从环境湿度调控角度预防或促进塑料的生物降解提供了新见解。
引言
聚氨酯（Polyurethane）因其可定制化的刚性或柔性结构，被广泛用于家居、汽车、船舶和飞机等领域的绝缘材料、家具、涂料、粘合剂和服装等。由于聚合物中存在无定形区域，使其容易受到微生物的侵蚀。由微生物活动引发的腐蚀每年造成数十亿美元的经济损失，其中部分源于塑料的降解。真菌的生长依赖于水分，但目前对平衡相对湿度（Equilibrium Relative Humidity, ERH）如何影响塑料降解的认知尚不充分。本研究旨在量化ERH对植物病原真菌Aureobasidium pullulans降解聚酯型聚氨酯（Polyester Polyurethane）泡沫的影响，并识别潜在的相关遗传途径。
Aureobasidium pullulans是一种普遍存在的多态性真菌，是典型的腐生真菌。它通过分泌多种酶分解周围环境中的分子，其中角质酶（Cutinase）能够断裂角质（植物蜡质保护层）中的酯键，这类酯键同样存在于塑料聚合物的碳骨架中，这使得A. pullulans有可能利用角质酶降解塑料。同时，水分是微生物驱动降解的关键，高相对湿度可上调真菌基因表达，包括与次级代谢物和过敏原产生相关的基因，并参与聚合物的水解过程。然而，ERH如何影响A. pullulans对聚氨酯的降解及其相关的角质酶基因表达途径，目前尚未可知。
本研究的目标是评估相对湿度如何影响A. pullulans降解聚酯型聚氨酯泡沫，并解析相关的生化途径。实验使用了从飞机和室内灰尘中分离出的三株环境A. pullulans菌株（AFRL64, AFRL76, OSU3）。
材料与方法
首先进行菌株筛选，基于Impranil（一种聚酯-聚氨酯）酶解圈试验，挑选出三株具有降解潜力的菌株。实验使用了商业蓝色聚酯型聚氨酯泡沫，切割并清洗后，将泡沫块称重，嵌入Difco马铃薯葡萄糖肉汤粉末作为模拟灰尘的营养源，通过雾化接种A. pullulans孢子。
湿度控制在50%、85%和100% ERH水平，通过盐溶液（MgCl2、NaCl）或去离子水调控孵育罐内的湿度。所有样品在25°C下分别孵育1周和2周。
孵育结束后，通过重量损失评估降解程度，并对泡沫进行清洗、干燥和再次称重。同时，通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）对孵育后的泡沫（有真菌生长和清洗后）进行成像，观察真菌生长和泡沫表面的物理变化。
为了评估外部碳源对降解的影响，还设置了营养可利用性实验，对比了含碳（马铃薯葡萄糖肉汤）和不含碳（最低限度培养基）的营养源对真菌生长（通过定量PCR (qPCR) 检测18S rRNA基因拷贝数）的影响。
通过提取孵育后样品中的总RNA，进行RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq），以分析不同ERH条件下基因表达的差异，特别是与角质酶相关的基因。对菌株AFRL64的特定角质酶基因进行了克隆，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 (DE3) 中表达，随后在添加了Impranil的平板上评估其水解能力。
结果
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重量损失与营养评估
孵育1周和2周后，泡沫质量较接种前均出现显著下降（配对t检验p < 0.0001）。较高的ERH与聚氨酯泡沫的百分比重量损失增加显著相关（ANOVA p = 0.0002）。在所有菌株中，100% ERH下观察到最大的重量损失。与50% ERH的样品相比，100%和85% ERH的样品重量损失显著更高（Tukey-Kramer成对比较p < 0.001 和 p = 0.007）。在100% ERH下，2周孵育的样品比1周显示出更高的重量损失百分比（p = 0.002）。另一方面，在不同ERH水平下，通过qPCR检测的真菌生长量，在添加最低限度培养基（无外源碳）和马铃薯葡萄糖肉汤（有碳）的泡沫样品之间没有显著差异，这表明泡沫本身可能提供了足够的碳源。
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扫描电子显微镜（SEM）成像
SEM图像清晰地显示了真菌生长和泡沫降解的迹象。未经处理的清洁泡沫表面光滑，没有凹坑或撕裂。在50%和85% ERH下，真菌细胞呈圆形附着在泡沫上，而在100% ERH下，真菌细胞形成生物膜覆盖泡沫表面。更重要的是，在清洗掉真菌后的泡沫表面图像中，观察到明显的降解迹象。对于菌株AFRL64和AFRL76，在100% ERH下清洗后的泡沫表面出现了裂纹和孔洞。而菌株OSU3在50%和100% ERH下清洗后的泡沫表面均出现了凹坑。这些视觉证据表明A. pullulans在降解泡沫，且最高的泡沫降解发生在100% ERH。
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基因组大小与角质酶基因鉴定
三株A. pullulans的基因组大小存在显著差异：AFRL64为27 Mb，AFRL76为77 Mb，OSU3为49 Mb。通过基因功能注释，在三株菌中总共预测到10个角质酶基因。AFRL64和OSU3各含有2个独特的推定角质酶基因，而AFRL76含有6个。其中，AFRL64的角质酶1与AFRL76的角质酶7序列相同，AFRL64的角质酶2与AFRL76的角质酶5相同。这些角质酶可分为长基因（约1896-2574碱基对）和短基因（约666-678碱基对）两类。基因表达热图分析显示，大部分角质酶基因在85%或100% ERH下的转录本计数最高。其中，长角质酶基因（如角质酶1和7）在较高ERH下的表达量显著增加。
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角质酶的表达与酶活验证
对AFRL64的两个角质酶基因（角质酶1和角质酶2）进行了克隆并在大肠杆菌中表达。在含有1% Impranil的平板上，表达AFRL64角质酶2基因的E. coli菌落周围出现了清晰的水解圈（halo），表明该酶具有水解聚酯-聚氨酯的能力。而表达角质酶1基因或空载体的对照菌落则没有出现水解圈。这为AFRL64的短角质酶（角质酶2）能够降解聚氨酯类化合物提供了初步证据。
讨论
本研究证实，ERH是影响A. pullulans降解聚酯型聚氨酯泡沫的关键环境因素。较高的ERH与更显著的泡沫重量损失、SEM图像中更清晰的降解迹象以及角质酶基因表达的上调相关联。A. pullulans作为腐生真菌，依赖水作为酶和可溶性单体的运输介质，因此湿度的增加可能促进了降解过程。
本研究的发现具有双重应用意义。一方面，在需要防止塑料降解的环境（如飞机、建筑材料），可通过控制环境湿度（降低ERH）来抑制A. pullulans等真菌的生长及其降解酶的表达，从而延长材料寿命，降低维护成本。另一方面，在希望促进塑料生物降解的场合（如垃圾填埋场），则可利用较高的湿度环境来加速聚氨酯等塑料的分解，为塑料污染治理提供一种潜在的生物解决方案。
此外，研究也揭示了所测试菌株间的遗传多样性，包括基因组大小和角质酶基因数量的差异，这可能与它们在不同环境中的适应性和降解效率有关。
局限性
本研究存在一定局限性，包括测试的菌株数量有限、孵育时间相对较短、以及实验在受控条件下进行，未能完全模拟自然环境中温度、湿度、光照波动以及微生物群落相互作用等复杂因素。SEM成像和重量损失提供了降解的间接证据，角质酶基因的表达上调与降解相关，但未通过放射性标记等方法直接证明角质酶蛋白的产生与泡沫质量损失之间的因果关系。此外，除了角质酶，其他酶类如漆酶（Laccase）、脂肪酶（Lipase）等也可能参与了降解过程。
结论
本研究明确了ERH对A. pullulans降解聚氨酯泡沫的促进作用。高ERH（85%和100%）导致更高的真菌生物量、更显著的泡沫重量损失和表面结构破坏，并上调了潜在的降解酶——角质酶基因的表达。从菌株AFRL64中鉴定出的一个短角质酶基因（角质酶2）在大肠杆菌中表达后，展现出了水解聚氨酯类似物Impranil的能力。未来研究可关注更长的孵育时间、以及其他环境因子（如温度、光照、氧气）对降解过程的影响。这些知识将有助于设计更可持续的材料使用策略和环境管理方案，无论是在需要保护塑料制品的建筑领域，还是在需要加速塑料废弃生物降解的环保领域。
