《European Journal of Human Genetics》：A prioritization framework for BRCA1/2 variants of uncertain significance identified by comprehensive genomic profiling
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随着综合基因组分析(CGP)在精准肿瘤学中的广泛应用，BRCA1/2意义不明确变异(VUS)的高检出率成为临床应用的主要障碍。针对此，研究人员开展了针对CGP数据中BRCA1/2 VUS的优先排序研究。他们通过整合10种计算预测工具并结合功能学证据，从526个BRCA1/2变异中筛选出10个致病性候选变异，其中以BRCA2:c.67 G>C (p.D23H)为例进行了功能验证。该研究提出的框架为真实世界CGP检测中发现的VUS提供了一种概念验证性的优先排序和解读方案，有望提升遗传性癌症易感基因的变异评估效率。
癌症治疗的未来在于“量体裁衣”，即精准肿瘤学。想象一下，医生能够像读取肿瘤的“基因蓝图”一样，通过一项名为综合基因组分析（Comprehensive Genomic Profiling, CGP）的技术，一次性扫描数百个癌症相关基因，找出驱动癌症生长的关键“开关”（即驱动基因突变），从而为患者匹配最有效的靶向药物。这项技术自2019年起已被日本国家医疗保险系统覆盖，用于晚期实体瘤患者，迄今已有超过10万患者从中受益。然而，在通往完美“蓝图解读”的道路上，一个巨大的绊脚石横亘在眼前：意义不明确变异（Variants of Uncertain Significance, VUS）。
VUS就像是基因蓝图上的“模糊笔迹”——检测到了变化，但现有知识无法明确判断它是会导致癌症的“坏开关”（致病），还是对健康无碍的“背景杂音”（良性）。在传统的、针对有强家族史患者的BRCA1/2基因（遗传性乳腺癌卵巢癌综合征的关键基因）检测中，VUS问题已存在，但在CGP的应用中，这个问题被急剧放大。CGP以不依赖于癌症类型（肿瘤不可知）的方式进行检测，并且能同时发现遗传性和体细胞变异，这使得BRCA1/2基因VUS的检出率远高于传统检测，高达75%以上。如此大量的VUS不仅阻碍了基于BRCA1/2突变（可预测对铂类化疗或PARP抑制剂敏感性）的治疗决策，也为遗传咨询和家系筛查带来了巨大困扰。如何从海量VUS中，有效、快速地识别出那些潜在有害、值得深入功能验证的变异，成为临床实践和转化研究中亟待解决的问题。
为了应对这一挑战，来自日本广岛大学医院及其合作机构的研究人员开展了一项研究，旨在分析真实世界CGP数据中的BRCA1/2变异图谱，并开发一个整合计算预测与功能证据的框架，来系统性地优先排序VUS。他们的研究成果发表在《European Journal of Human Genetics》期刊上。这项研究的意义在于，它为解决CGP时代VUS泛滥的临床困境提供了一个概念验证性的实用流程，该流程不仅提升了BRCA1/2 VUS的解读效率，其方法论也具备推广至其他遗传性癌症易感基因评估的潜力。
为了开展研究，研究者利用了2019年9月至2025年7月期间，在日本广岛大学医院及其附属合作医院完成的2172例CGP检测数据。这些检测涵盖了多种临床批准的CGP平台，样本来源包括肿瘤组织或血浆游离DNA。研究首先对识别出的所有BRCA1/2变异进行筛选，排除已知致病/良性变异、人群等位基因频率高于0.1%的变异等，最终得到153个候选VUS用于后续分析。核心的分析方法在于整合了10种计算（in silico）预测工具（CADD, SIFT, PolyPhen-2, SpliceAI, REVEL, BayesDel, MetaSVM, PrimateAI, phyloP100, MaxEntScan），利用从Franklin工具衍生的数值阈值对这些VUS进行致病性评分和初步筛选。对于被预测为潜在有害的变异，研究人员进一步查阅文献和公共数据库，寻找已有的功能学证据。对于缺乏现有功能证据的关键候选变异，研究者则进行了后续的功能实验验证。在针对BRCA2:c.67 G>C (p.D23H)的功能分析中，他们使用了从患者血液中提取的RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应和Sanger测序，在患者体内验证了该变异引起的剪接异常。
BRCA1和BRCA2变异在CGP检测中的情况
通过对2172例CGP检测的分析，研究共鉴定出526个BRCA1/2变异，其中396个（75.3%）被归类为VUS。致病性变异既出现在经典的HBOC相关癌症（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌）中，也有36%出现在非经典HBOC相关癌症中。而VUS则主要（68.4%）出现在非经典HBOC相关癌症中。这些VUS广泛分布在基因的各个功能域，凸显了对VUS致病性进行重新评估的重要性。经过初步筛选，153个VUS被选为后续计算分析候选。
真实世界CGP中预测评分的分布与变异优先排序
研究团队应用了10种计算预测工具对153个VUS进行评分。结果显示，绝大多数变异未超过预设的致病性阈值。在交叉比较中，共有39个变异（25.5%）被至少一种预测工具预测为致病。值得注意的是，SIFT预测了37个变异为致病，但其中29个未得到其他预测工具的支持，表明SIFT单独使用的特异性不足。在排除了这些仅被SIFT支持的变异后，最终有10个VUS被优先选出用于进一步的功能解读，包括2个剪接位点变异和8个错义变异。
基于新产生和已发表证据对优先变异进行功能评估
在10个优先变异中，BRCA1:c.5107 T>A (p.Y1703N), BRCA2:c.7523 G>A (p.G2508D) 和 BRCA2:c.7795 G>A (p.E2599K) 在已发表的同源重组修复（HDR）或饱和基因组编辑（SGE）功能实验中已被证明具有有害效应。相反，BRCA2:c.7522 G>A (p.G2508S) 和 c.8437 G>C (p.G2813R) 在功能实验中显示为中性。BRCA1:c.241 C>G (p.Q81E) 在SGE数据中显示为中等活性，可能是一个功能减弱的等位基因。BRCA2:c.3044 A>T (p.K1015M) 在现有大规模功能数据中缺乏注释。BRCA2:c.67 G>C (p.D23H) 在近期研究中已被体外实验提示有害，但其体内临床证据和具体致病机制尚不明确，因此被选作深入研究的典型案例。
BRCA2:c.67 G>C变异致病性的潜在机制
BRCA2:c.67 G>C位于外显子2/内含子2边界，计算预测（SpliceAI）提示其可能导致异常剪接。为了在人体内验证这一点，研究人员对携带该变异患者的血液RNA进行了RT-PCR分析。结果显示，与健康对照相比，患者样本中出现了更小的扩增片段。对该片段的Sanger测序证实，发生了外显子2的完全跳跃。由于外显子2包含翻译起始位点，其跳跃将导致BRCA2蛋白功能丧失，这从分子机制上解释了该变异的致病性。
本研究的结论和讨论强调了CGP极大地扩展了BRCA1/2检测的临床场景，但也导致了VUS数量的激增，这已成为影响精准治疗实施和遗传咨询的主要瓶颈。研究团队为此提出了一个创新的、可操作的解决方案：一个整合了多种计算预测工具的过滤和优先排序框架。这个框架并非用于直接的ACMG/AMP临床分类，而是作为一个上游筛选工具，从海量VUS中高效地“打捞”出最值得进行下游功能验证的候选者。与仅使用ENIGMA（Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles）专家组指定的两种预测工具（BayesDel和SpliceAI）的策略相比，本研究的“十工具”框架识别出了额外的、已被大规模功能实验证实有害的变异，显示了其更广的覆盖面和更高的灵敏度。
研究通过对BRCA2:c.67 G>C的深入剖析，完美演绎了这一框架的价值。它不仅通过患者来源RNA的RT-PCR和测序，在体内直接证实了预测的外显子2跳跃现象，提供了PS1（剪接）_中等强度的证据，还通过两名携带此变异患者的临床数据（分别对铂类化疗和PARP抑制剂联合治疗表现出敏感性），提供了支持同源重组缺陷（HRD）表型的临床证据。这为最终将该变异重新分类为致病性提供了强有力的多维度支持。这个案例表明，将CGP产生的真实世界临床数据、计算预测与功能实验证据相结合，是解决VUS临床解读难题的有效途径。
这项研究的重要意义在于，它首次在大型真实世界CGP队列中系统描绘了BRCA1/2 VUS的图谱，并开发并验证了一个概念性的优先排序框架。这个框架具有普适性，其核心逻辑——利用计算工具进行高效初筛，再结合功能与临床证据进行深度解读——可以推广至Lynch综合征（林奇综合征）相关的错配修复基因或其他遗传性癌症易感基因的VUS评估中，从而在更广泛的层面上提升CGP的临床效用。尽管研究存在单中心队列、功能验证范围有限等局限性，但它为加速VUS的临床解读、连接基因组图谱与临床决策，迈出了坚实而关键的一步，为未来的多中心协作和国际数据库整合奠定了基础。
