《International Journal of Oral Science》：Soluble Notch agonist enables human ameloblast maturation and enamel-like tissue formation for tooth regeneration
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为解决成人釉质损伤后无法再生、以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的诱导成釉细胞（iAM）成熟需依赖与成牙本质细胞共培养的难题，研究者利用人工智能设计的可溶性Notch激动剂（C3-DLL4）成功驱动iAM独立成熟，并首次在体内形成釉质样钙化组织。这项研究为牙齿再生和釉质发育不全（AI）等疾病的机制研究提供了新平台。
想象一下，你身体里最坚硬的物质是什么？答案可能让你惊讶——是牙齿的釉质。这层闪耀的保护层守护着下方的牙本质和牙髓。然而，釉质有一个致命的弱点：一旦在发育完成后受损，人体就失去了修复它的能力，因为负责制造釉质的成釉细胞会随着牙齿萌出而凋亡。超过90%的成年人都有釉质缺损或损伤的问题。这不仅影响美观，更是龋齿（蛀牙）等常见口腔疾病的根源。如何让失去的釉质“再生”，成为了再生牙科学领域一个极具挑战性的“圣杯”。
近年来，人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术的发展带来了曙光。科学家们已经能够将hiPSC诱导分化为成釉细胞样细胞（iAM），这为未来利用细胞疗法修复釉质提供了可能的细胞来源。但是，这条通往再生的道路卡在了一个关键环节：iAM细胞难以成熟为具有分泌功能的成釉细胞。此前的研究发现，iAM的成熟似乎离不开与另一种细胞——负责形成牙本质的成牙本质细胞（Odontoblast, OB）的“亲密接触”。为什么会有这种依赖？成牙本质细胞究竟提供了什么关键信号来“唤醒”成釉细胞？这个谜题不解开，体外规模化培养功能性成釉细胞、进而实现釉质再生的目标就难以实现。
这项发表在《International Journal of Oral Science》上的研究，正是为了破解这一谜题。研究人员决心找出驱动成釉细胞成熟的关键信号，并建立一个无需成牙本质细胞共培养的、高效的成釉细胞成熟体系。他们的探索从分析人类胎儿牙齿发育的单细胞测序数据开始。通过生物信息学分析，他们锁定了Notch信号通路——一个在细胞分化中扮演关键角色的高度保守的信号机制。分析显示，在发育晚期，成牙本质细胞高表达Notch的配体Delta（如DLL1， DLL4），而成釉细胞则高表达Notch受体（NOTCH1， NOTCH2， NOTCH3），这强烈暗示了从成牙本质细胞到成釉细胞的Notch信号传递。
为了验证这个猜想，研究人员首先建立了hiPSC来源的成釉细胞（iAM）与成牙本质细胞（iOB）的共培养体系。当两者共培养时，iAM成功成熟并开始分泌釉质的关键蛋白釉质蛋白（Enamelin, ENAM）。然而，当他们在共培养中加入DAPT（一种γ-分泌酶抑制剂，能阻断Notch信号通路）后，ENAM的表达被显著抑制。这证明Notch信号对于共培养体系中的成釉细胞成熟是必需的。
那么，是否激活Notch信号就足以替代成牙本质细胞的作用呢？为此，研究人员使用了一种“高科技武器”——一种通过人工智能设计的可溶性Notch激动剂蛋白，称为C3-DLL4。这个蛋白是一个经过计算设计的支架，以三聚体的形式呈现DLL4配体，能够有效激活细胞表面的Notch受体。实验证明，C3-DLL4能够强力激活报告细胞系中的Notch信号。
接下来，激动人心的发现出现了。研究人员将C3-DLL4直接添加到单独培养的iAM类器官（一种三维细胞团，能更好地模拟体内细胞环境）中，而完全不需要成牙本质细胞的陪伴。结果令人振奋：C3-DLL4处理的iAM类器官发生了显著的成熟转变。RNA测序分析显示，它们的基因表达谱从早期成釉细胞状态，转向了高表达分泌期和成熟期成釉细胞标志物的状态，例如釉原蛋白（AMELX）、釉质蛋白（ENAM）、基质金属蛋白酶20（MMP20）、以及成熟标志物如激肽释放酶4（KLK4）、成釉蛋白（ODAM）、FAM83H和TUFT1。免疫荧光染色也直观地证实了ENAM和MMP20蛋白的表达大幅上调，并且细胞形成了具有极性的、有组织的上皮结构。研究人员将这种由C3-DLL4诱导产生的、高度成熟的细胞状态命名为诱导分泌期成熟成釉细胞（ismAM）。
更有力的是，当将这些经过Notch激活的ismAM类器官移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下（一个常用的体内实验部位），微型计算机断层扫描（microCT）显示移植部位出现了钙化材料。组织学分析进一步证实，这些钙化区域源自移植的人源细胞，并且这些细胞在体内依然保持极性，持续表达ENAM、WDR72（另一个成熟成釉细胞标志物）等蛋白。这标志着首次在无需成牙本质细胞参与的情况下，由人工诱导的成釉细胞在体内形成了釉质样钙化组织。
这项研究的另一个重要贡献是利用这个新的、不依赖共培养的成熟体系，深入剖析了一个与釉质发育不全（AI）密切相关的基因——DLX3的功能。DLX3是一个转录因子，其突变会导致釉质发育不全，全基因组关联分析（GWAS）也发现其与龋齿风险相关。但DLX3究竟是在成牙本质细胞中发挥作用，还是在成釉细胞中自主发挥作用，一直不甚清晰，部分原因是难以在实验中分离这两种细胞的功能。
研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了DLX3基因敲除（KO）的iPSC系。在成牙本质细胞分化体系中，DLX3的缺失确实导致牙本质涎磷蛋白（DSPP）表达大幅下降，这与已知功能一致。然而，当他们将DLX3 KO的iPSC诱导分化为成釉细胞，并用C3-DLL4促使其成熟时，发现了新的关键现象：DLX3的缺失并不影响成釉细胞的早期分化和细胞极性，但却严重阻碍了其终末成熟。与野生型细胞相比，DLX3 KO的ismAM类器官几乎完全无法表达ENAM、MMP20、AMELX、WDR72、KLK4等一系列关键的釉质基质蛋白。转录组分析也显示，DLX3 KO细胞停滞在早期状态，无法开启成熟的分泌程序。这首次在人类细胞模型中明确证明，DLX3在成釉细胞中是细胞自主必需的，它特异地调控着釉质基质蛋白的表达，是成釉细胞实现终末成熟的关键开关。
本研究主要运用了以下几项关键技术：1）基于hiPSC的定向分化技术，分别构建了成釉细胞（iAM）和成牙本质细胞（iOB）的血清Free分化体系；2）三维类器官培养技术，用于模拟成釉细胞的体内发育微环境；3）计算设计与蛋白质工程，合成了可溶性Notch激动剂C3-DLL4；4）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DLX3基因敲除的iPSC系；5）移植实验（肾包膜下移植）结合microCT成像和组织学分析，用于评估类器官在体内的成矿能力。
研究结果
Notch通路在成釉细胞成熟过程中的作用
通过对人类胎儿组织单细胞测序数据的TopPath算法分析，发现Notch是成牙本质细胞与成釉细胞通讯中的候选关键信号通路。表达谱热图显示，配体（DLL1， DLL4）主要在成牙本质细胞表达，而受体（NOTCH1， NOTCH2， NOTCH3）主要在分泌期成釉细胞表达。在iAM与iOB的共培养体系中，Notch抑制剂DAPT处理能显著降低成釉细胞标志物ENAM的表达，证明Notch信号对该体系中的成釉细胞成熟是必需的。
可溶性Notch激动剂
研究采用了一种人工智能设计的可溶性Notch激动剂C3-DLL4，它是一种三价支架蛋白，与DLL4胞外域融合而成，能够在溶液中有效激活Notch信号，这通过Notch1-Gal4报告基因实验得到了验证。
Notch激活在共培养体系中加速iAM成熟
在iAM与iOB的共培养体系中加入C3-DLL4，能够增强成熟釉质基质蛋白标志物ENAM和MMP20的表达，表明Notch激活可以促进共培养条件下的成釉细胞成熟。
C3-DLL4在没有共培养的情况下加速iAM成熟
将C3-DLL4单独用于iAM类器官（无iOB共培养），可诱导其转录组向分泌期和成熟期成釉细胞状态转变，并显著上调ENAM、MMP20、AMELX等蛋白的表达，同时细胞呈现极化和组织化。相反，用DAPT抑制Notch信号则阻碍了这些成熟标志物的表达。这表明可溶性Notch激动剂足以驱动成釉细胞独立成熟。
C3-DLL4处理的AM类器官在肾包膜下形成釉质样矿化材料
将C3-DLL4诱导的成熟ismAM类器官移植至NOD-SCID小鼠肾包膜下，microCT和组织学分析证实移植部位形成了钙化物质。移植的类器官保持了上皮极性，并持续表达ENAM、WDR72、KLK4、MMP20等成釉细胞标志物，首次证明了Notch激活的iAM类器官能在体内形成釉质样组织。
DLX3转录因子是人成釉细胞成熟所必需的
分析显示，DLX3基因上游的单核苷酸多态性（SNP）与龋齿患病率相关，且DLX3在人和小鼠的成釉细胞和成牙本质细胞谱系中均有表达。利用DLX3敲除（KO）的iPSC系进行研究发现：在成牙本质细胞分化中，DLX3缺失导致其成熟标志物DSPP表达大幅下降。在成釉细胞分化中，DLX3缺失不影响早期标志物（如AMBN， SP6）表达和细胞极性，但严重损害了终末成熟。经C3-DLL4诱导后，DLX3 KO的成釉细胞类器官无法有效表达ENAM、MMP20、WDR72、KLK4等一系列关键的釉质基质蛋白。转录组分析也证实其成熟程序受阻。这明确了DLX3在人类成釉细胞中是细胞自主必需的，专门调控其终末成熟和釉质基质蛋白表达。
讨论与结论
本研究揭示了Notch信号是介导成牙本质细胞与成釉细胞相互作用、促进后者成熟的关键机制。通过计算设计的可溶性Notch激动剂C3-DLL4，研究人员成功建立了一个无需成牙本质细胞共培养的人成釉细胞高效成熟体系。这一突破性进展不仅证明了Notch激活足以驱动成釉细胞完成终末分化，还使得在体外分离研究成釉细胞自身的内在机制成为可能。
利用这一新体系，研究首次在人类细胞模型中明确阐明了釉质发育不全相关基因DLX3在成釉细胞谱系中的细胞自主性功能：DLX3对于成釉细胞的早期分化和极性建立并非必需，但却是其实现终末成熟、启动釉质基质蛋白（如ENAM， MMP20， WDR72）表达不可或缺的转录调控因子。这一发现增进了我们对釉质发育不全病因的理解，并揭示了DLX3相关遗传变异可能通过影响成釉细胞功能而增加个体龋齿风险的潜在机制。
此外，研究首次展示了由Notch激活诱导产生的人成釉细胞类器官在移植后能够在体内形成釉质样钙化组织，为未来基于细胞的牙齿釉质再生策略提供了概念验证和重要的实验基础。
总之，这项研究通过创新的蛋白质设计工具破解了成釉细胞成熟依赖共培养的难题，建立了一个强大的人类成釉细胞研究平台。该平台不仅能用于深入解析釉质发育和疾病的分子机制，也为筛选和验证与龋齿等口腔疾病相关的遗传变异的功能提供了前所未有的机会，最终将推动针对世界上最普遍疾病之一——龋齿的新疗法开发。
