《Journal of Integrative Plant Biology》：De novo stolon organogenesis in potato leaf callus elicited by Agrobacterium tumefaciens stimulus
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本文综述了马铃薯叶片愈伤组织在农杆菌刺激下高效再生匍匐茎及其后块茎发育的新方法。研究证实，活体农杆菌（特别是C58染色体背景）的相互作用是关键，其诱导磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族基因（如StSP6A和StCENL1）表达上调，从而启动匍匐茎的从头器官发生。此技术不仅突破了多能性愈伤组织仅再生常规器官（如枝、根）的限制，还为通过缺乏连续维管系统的愈伤中间体再生无病毒块茎提供了一条潜在新途径。
植物能够从离体叶片中通过细胞重编程形成多能性愈伤组织。然而，尽管具有多能性，但迄今为止，从叶片愈伤组织再生的器官大多局限于常规的枝条和根，其再生其他特化器官的潜力尚不清楚。在本研究中，我们发现匍匐茎可以从马铃薯叶片愈伤组织中再生。进一步研究表明，农杆菌刺激能够高效地诱导马铃薯叶片愈伤组织再生匍匐茎及其后续的块茎发育。当去除细菌培养物的生物活性后，匍匐茎再生的诱导效应消失，表明该过程需要活的细菌细胞。通过使用不同菌株的比较实验，我们发现C58染色体背景对于这种增强作用是必需的。整合转录组分析和转基因功能验证，我们发现磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族基因密切参与了这一响应。此外，我们观察到病毒不易通过愈伤组织扩散到再生的匍匐茎，因为愈伤组织缺乏连续的维管系统作为病毒移动的通道。我们的研究结果表明，细菌刺激能从多能性叶片愈伤组织中触发匍匐茎再生，为生产无病毒的马铃薯块茎提供了一种潜在方法。
匍匐茎样组织可直接从马铃薯叶片愈伤组织诱导再生
从马铃薯枝条获取的节段插条，在含高蔗糖的培养基上、黑暗条件下培养，可诱导节部发育匍匐茎。我们假设，在添加了常规枝条再生所需植物激素的类似培养条件下，马铃薯叶片愈伤组织也能激活类似的器官发生过程。我们将此培养基命名为匍匐茎诱导培养基。实验证实，具有细长假茎、钩状尖端且无叶绿素的匍匐茎样组织确实可直接从叶片愈伤组织再生，尽管在此条件下效率较低。更重要的是，这些组织大多后续发育成了块茎，因此我们称其为再生匍匐茎样组织。我们随后尝试通过将马铃薯叶片外植体与携带pCAMBIA1301 GUS表达载体的农杆菌GV3101菌株共培养，以期从匍匐茎样组织产生转基因块茎。出乎意料的是，与未处理和仅培养基对照组相比，叶片愈伤组织形成匍匐茎样组织的效率急剧增加。值得注意的是，即使是不含二元载体的GV3101也能促进匍匐茎样组织的形成，这表明农杆菌与马铃薯叶片外植体之间的相互作用在这种条件下激活了匍匐茎样器官发生。虽然GV3101预处理导致了匍匐茎样组织的强力诱导，但约70%–90%的再生组织是非转基因的。这些发现支持是初始的细菌刺激，而非转基因整合，触发了叶片愈伤组织的匍匐茎再生。为了评估匍匐茎样组织的特征，我们分析了已知在常规匍匐茎中高表达的基因。在检测的23个候选基因中，有9个在匍匐茎样组织中的表达量比常规枝条高4倍以上，这表明匍匐茎样组织与常规匍匐茎具有共同的分子特征。
PEBP家族基因诱导匍匐茎样组织再生
虽然马铃薯块茎化过程已被广泛研究，但此前尚无研究鉴定出在块茎发育之前特异性诱导匍匐茎形成的分子调控因子。因此，我们对经GV3101预处理的叶片愈伤组织进行了RNA测序，并分析了差异表达基因，以确定负责匍匐茎样组织形成的分子因子。通过比较公开的组织特异性转录组数据，我们鉴定出GV3101调控的、在匍匐茎和/或块茎中表达水平特异性高于其他组织的基因。其中，我们发现了两个磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族基因：StSP6A和StCENL1。PEBP家族基因，包括FLOWERING LOCUS T及类似蛋白，已知在多种植物物种的诱导开花中起关键作用。在马铃薯中，它们除了参与开花外，还是贮藏器官发育的关键调控因子。为了验证我们的转录组分析结果，我们使用额外的生物学重复进行了RT-qPCR。由于重复间差异较大，仅在培养8周后上调表达的StSP6A显示出统计学显著性。StCENL1的表达在GV3101预处理组也有增加，但处于统计学显著性的临界值。与块茎发育相关但未在我们的转录组数据中识别的其他基因，在GV3101预处理后未显示显著差异。同样，对常规枝条器官发生相关基因的分析也未发现显著差异。为了进一步研究PEBP基因在匍匐茎样组织形成中的作用，我们构建了StSP6A和StCENL1的过表达株系，并使用了源自这些转基因植物的叶片愈伤组织。在三个独立的35S:StSP6A转基因株系中，有两个在没有GV3101预处理的情况下，匍匐茎样组织的形成效率有所提高。同样，三个35S:StCENL1转基因株系都显示出显著增强的匍匐茎样组织形成能力。这些结果表明，PEBP家族基因的诱导表达与匍匐茎样组织形成相关。为了验证StCENL1和StSP6A在匍匐茎样组织再生中的作用，将马铃薯叶片外植体接种携带针对各基因的RNA干扰载体的农杆菌菌株，随后在匍匐茎诱导培养基上培养。我们观察到，虽然StCENL1沉默效果不佳，但StSP6A沉默显著降低了匍匐茎样组织的再生频率。通过RT-qPCR确认了RNAi构建体的基因沉默效率，StCENL1表达保持不变，而StSP6A转录本水平显著降低。这些数据表明，观察到的空载体与StCENL1 RNAi组之间类似的匍匐茎再生效率，可能归因于StCENL1 RNAi构建体的沉默效率低。尽管StCENL1沉默的影响尚无定论，但我们的发现清楚地表明StSP6A是农杆菌诱导的匍匐茎样组织形成所必需的。鉴于匍匐茎样组织与常规匍匐茎的共享特征，以及贮藏器官调控因子StSP6A的参与，很明显匍匐茎样组织在功能上等同于真正的匍匐茎。
活的农杆菌与马铃薯叶片愈伤组织的相互作用激活了匍匐茎的从头器官发生
细菌的细胞成分可作为刺激物，诱导植物细胞的防御反应。因此，我们研究了这些分子模式是否也作为匍匐茎再生的诱导剂。我们制备了四种源自细菌细胞培养物的混合物：完整的GV3101细胞培养物、含细菌分泌分子的培养上清、消除细菌生物活性及热不稳定分子（如蛋白质）的高压灭菌培养物，以及破碎细菌细胞的超声处理培养物。只有用完整GV3101细胞培养物处理的对照组，其匍匐茎再生效率有显著提高。这些数据表明，预先形成的细菌分子模式不影响匍匐茎再生；相反，GV3101与叶片愈伤组织相互作用时的生物活性对此过程至关重要。工程化的农杆菌菌株拥有染色体DNA和Ti辅助质粒。为了研究这些基因组组件在匍匐茎再生中的作用，我们使用了缺少Ti辅助质粒但保留C58染色体的C58C1菌株，以及具有与GV3101不同染色体背景的LBA4404菌株。C58C1预处理具有与GV3101相似的效果，而LBA4404的效果则显著较差。支持这些结果的是，在LBA4404预处理组中，PEBP家族基因的表达显著低于GV3101处理组，而非PEBP基因StAGL11则无显著差异。这些发现表明，农杆菌的C58染色体在激活马铃薯叶片愈伤组织的匍匐茎再生中起着关键作用。为了检查参与农杆菌诱导匍匐茎再生的分子因子，我们对培养8周后的叶片愈伤组织进行了RNA测序，并分析了相对于0周的差异表达细菌基因。尽管有几个细菌基因上调，但使用额外生物学重复进行的RT-qPCR验证显示变异性很高，在匍匐茎再生期间，排名靠前的基因均无统计学显著性。基于这些结果，我们得出结论，细菌与叶片愈伤组织之间的初始相互作用激活了植物细胞内的分子信号传导，而非持续的细菌基因表达直接驱动匍匐茎再生。为了进一步研究不同农杆菌菌株诱导匍匐茎再生能力的差异，我们进行了全基因组测序和比较单核苷酸多态性分析。由于GV3101和C58C1共享C58染色体背景，而LBA4404含有Ach5背景，因此在LBA4404中鉴定出大量SNP。为了缩小候选基因范围，我们筛选了导致关键密码子变化的SNP，特别是终止获得、终止丢失和起始丢失替换。此筛选过程鉴定出209个终止获得、42个终止丢失和71个起始丢失SNP。广泛的基因组差异和大量关键SNP表明，LBA4404诱导能力的降低可能是多种遗传变异协同作用的结果。我们接下来研究了农杆菌诱导的匍匐茎再生是否可以应用于不同的马铃薯品种。在测试的六个不同品种中，除Bintje外，其他品种都成功实现了匍匐茎再生和随后的块茎形成，表明该方法在大多数马铃薯品种中具有广泛适用性。为了研究Bintje缺乏再生反应的原因，我们分析了在匍匐茎诱导培养基培养期间，经农杆菌共培养后StSP6A和StCENL1的表达。结果显示，在Desiree中，这些基因的表达显著增加，而在Bintje中，它们的表达在培养期间基本保持不变。这些发现证实了StSP6A和StCENL1的诱导与匍匐茎再生密切相关。接下来，我们研究了通过匍匐茎再生引入块茎的转基因在克隆繁殖过程中是否保持稳定。我们选择了来自Victoria叶片愈伤组织匍匐茎再生产生的表达GUS的转基因块茎，并通过块茎发芽进行了两代克隆繁殖。在第一代和第二代中，所有块茎都保留了GUS基因表达，表明通过匍匐茎再生产生的转基因块茎可以稳定繁殖。
可从病毒感染叶片再生无病毒匍匐茎
既然已确定匍匐茎的从头器官发生通过愈伤组织中间体进行，我们推断愈伤组织阶段可作为对抗病毒系统性传播的生物过滤器。因为植物病毒通常利用成熟的连续维管组织进行移动，而从无维管系统的愈伤组织再生匍匐茎，为将器官发育与病毒转运脱钩提供了机会。此外，病毒感染是马铃薯产量限制的主要因素，因为受感染的植物产量显著降低。因此，我们研究了是否可以从病毒感染叶片组织再生无病毒匍匐茎。为此，我们获得了在韩国海南田栽培的商业化Atlantic块茎，预计其自然感染了病毒。正如预期，从这些块茎发芽的几株植株表现出典型的花叶病毒症状。为了鉴定病毒基因组，我们进行了从头转录组组装。对组装读段的BLASTX分析揭示存在一种完整的病毒，即马铃薯Y病毒。从PVY感染叶片衍生的愈伤组织产生了再生匍匐茎。在分析的七个再生匍匐茎中，有四个显示出PVY RNA水平的急剧降低，证明可以通过从受感染叶片愈伤组织再生匍匐茎直接获得无病毒匍匐茎。总体而言，我们的研究结果表明，多能性叶片愈伤组织可以分化为匍匐茎等特化器官，并且叶片愈伤组织的器官发生潜力可以通过外部刺激得到扩展。这项技术为在马铃薯中生成无病毒贮藏器官提供了一个有前景的策略。
讨论
自植物组织培养起始以来，愈伤组织形成常被描述为脱分化过程，因为可以从多能性愈伤组织中诱导产生新的枝条或根器官发生。然而，最近的讨论对将愈伤组织归类为真正脱分化组织提出了争议。如果愈伤组织形成严格是脱分化过程，那么源自不同器官类型的愈伤组织应表现出相似的性质。尽管如此，许多基因在空中组织来源和根来源的愈伤组织中显示出不同的表达模式。支持这些发现的是，从愈伤组织再生的器官类型通常高度依赖于原始来源组织。在大麦中，根来源的愈伤组织主要再生根，而未成熟胚来源的愈伤组织则再生枝条。类似地，在拟南芥中，雌蕊来源的愈伤组织再生的是生殖器官，而非常规的营养枝条。这些观察结果表明，愈伤组织保留了与其来源组织密切相关的特定性质。然而，我们的研究表明，通过外源刺激，可以从叶片来源的愈伤组织再生匍匐茎，而非从匍匐茎或块茎再生。这一发现提供了证据，表明可再生器官类型的限制可以被克服，这暗示愈伤组织可能确实表现出类似脱分化的可塑性。类似于茎尖分生组织在阶段转变过程中响应发育信号形成不同器官类型，赋予目标器官特性的关键基因的异位表达可能会扩展器官类型范围。除了PEBP家族基因，我们的转录组分析还揭示，在马铃薯中，作为贮藏蛋白参与块茎发育和淀粉积累的patatin-like蛋白基因在培养8周时，在农杆菌处理的愈伤组织中上调。然而，越来越多的证据表明patatin-like基因是多功能的：它们被微生物刺激诱导，并有助于早期防御反应，同时也参与发育过程。这些发现引发了一种可能性，即patatin-like蛋白可能有助于器官发生的重编程。未来研究patatin-like基因的功能作用，对于充分理解匍匐茎形成的分子框架将很有价值。虽然我们观察到农杆菌GV3101共培养显著提高了匍匐茎再生效率，但含有二元载体pC1301的GV3101进一步提高了该效率。尽管目前对此尚无确凿证据，我们提出两种假设。首先，从二元载体切割下来的T-DNA本身可能作为外源DNA诱导植物细胞产生各种反应。据报道，细菌DNA会在植物中引起免疫反应，包括产生活性氧和沉积胼胝质。因此，转入植物细胞的T-DNA可能诱导影响PEBP家族基因表达的免疫反应。其次，二元载体中的选择标记可能有助于筛选活的细菌细胞。由于活菌可以提高匍匐茎再生效率，在给定OD600浓度下，高比例的活菌细胞可能增强匍匐茎再生。细菌与植物之间的相互作用通常与植物防御反应的激活相关。植物细胞通过模式识别受体识别微生物相关分子模式，触发免疫相关基因的表达。除了防御反应，微生物信号还能促进植物的组织再生和器官发生。在我们的研究中，用农杆菌GV3101预处理似乎激活了马铃薯叶片愈伤组织的防御反应。然而，农杆菌诱导匍匐茎再生的确切分子机制仍不清楚。基于我们的发现，即在叶片愈伤组织中未检测到显著上调的细菌基因，且只有C58染色体背景能有效诱导匍匐茎再生，细菌与植物细胞之间的初始相互作用可能影响了细菌染色体基因组，以产生目前尚未鉴定的分子因子。这些因子可能重编程植物染色质景观，导致对匍匐茎再生至关重要的PEBP家族基因表达升高。总之，我们建立了一种从马铃薯叶片愈伤组织诱导匍匐茎再生的方法。我们的研究结果表明，PEBP家族基因的表达与此过程密切相关。值得注意的是，活体农杆菌的存在显著增强了愈伤组织的匍匐茎再生。该方法适用于各种马铃薯品种，有望对生产转基因和无病毒块茎非常有用。本研究为从植物愈伤组织诱导多种器官提供了有价值的见解，并将有助于未来关于植物再生机制的研究。
