《Lab Animal》：The adrenal stress response involves distinct dynamics of both cortisol and corticosterone in the axolotl salamander
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本研究针对蝾螈应激通路在损伤与再生过程中的作用尚未明确、其主导糖皮质激素（GC）种类不明的问题，开展了墨西哥钝口螈肾上腺应激反应的系统性研究。研究团队通过药理学挑战、手动应激、离体组织培养及体内成像等技术，揭示了皮质醇和皮质酮在不同应激条件下（如手动刺激、损伤、AVT/ACTH给药）呈现不同的释放动力学与调控机制，提出了皮质醇可能作为其主导糖皮质激素，并部分作为儿茶酚胺系统的延伸发挥作用的新假说。该研究不仅为将应激激素测量纳入广泛的蝾螈研究提供了方法学支持，也为理解应激通路在再生生物学中的复杂角色提供了关键见解。
墨西哥钝口螈是一种神奇的模式生物，以其卓越的器官和肢体再生能力而闻名于世。然而，在再生研究中，启动再生反应的损伤信号，特别是其中可能涉及的应激通路的作用，目前仍不甚明了。这主要是因为，损伤与应激在时间上是紧密关联的，但墨西哥钝口螈的应激通路激活情况在很大程度上仍是未解之谜，甚至连其主导的糖皮质激素是哪种都尚未有定论。在脊椎动物中，主导的糖皮质激素因物种而异，例如皮质醇是人类和硬骨鱼的主要激素，而皮质酮则在啮齿类、鸟类和爬行类中占主导。传统观点认为，包括大多数蝾螈在内的两栖动物，其应激反应以皮质酮为主。这种知识空白，无疑限制了我们全面理解再生过程及其与应激系统的相互作用。为了填补这一空白，一个国际研究团队在《Lab Animal》上发表了一项深入研究，旨在系统地表征墨西哥钝口螈的肾上腺应激反应，并提供测量其应激激素的方法，以推动其在发育和再生等广泛研究领域的应用。
研究人员运用了多种体内外实验技术来解答上述问题。关键的实验方法包括：1) 药理学挑战实验：对动物肌肉注射（i.m.）促肾上腺皮质激素（ACTH）或静脉注射（i.v.）精氨酸加压催产素（AVT），模拟经典的下丘脑-垂体-肾间（HPI）轴激活，并收集系列时间点的血浆、粘液和组织样本，通过商业ELISA试剂盒测定激素水平。2) 生物应激模型：设计了模拟实验操作的“手动应激”程序，以及标准的肢体截肢损伤模型，用以研究生理相关的应激反应。3) 体外组织孵育：从动物体内分离肾上腺组织，在培养基中直接加入AVT、ACTH、乙酰胆碱（ACh）或肾上腺素等潜在刺激因子，孵育后分别测定组织和培养基中的激素浓度，以探究激素合成与释放的调控机制。4) 分子成像与生理测量：使用正电子发射断层扫描（PET）和放射性葡萄糖类似物（18F-FDG）在体监测糖皮质激素对组织葡萄糖摄取的影响；通过超声心动图测量心率，并使用血糖仪监测血糖变化。5) 分子组织学分析：利用荧光杂交链式反应原位杂交技术，在肾上腺组织切片上检测关键酶（如CYP11β1、CYP17）和受体（MCR2）的mRNA表达，以探索激素产生细胞的异质性。所有实验动物均为1.0-2.0岁、混合性别的墨西哥钝口螈。
研究结果
ACTH激发试验增加了axolotl血浆中的皮质醇和皮质酮水平，其中皮质酮占主导
肌肉注射ACTH后，血浆中皮质醇和皮质酮水平均显著升高，并在1小时后达到峰值。与注射生理盐水的对照组相比，这种升高是ACTH特异的。重要的是，在峰值时，皮质酮的上调幅度显著高于皮质醇，表明在ACTH激活经典HPI轴通路时，皮质酮是主导的糖皮质激素。粘液样本中仅检测到皮质酮的升高。此外，肾上腺组织内的两种激素浓度也在ACTH刺激后增加，且皮质酮的增加更为显著。
Axolotls在给予AVT时产生内源性ACTH
静脉注射AVT后，血浆ACTH水平迅速升高，证实了AVT在axolotl中具有促ACTH释放的作用。随后，血浆皮质醇和皮质酮水平也相应增加。与ACTH试验结果一致，皮质酮的增加在幅度上再次占据主导地位。这些结果表明，通过AVT激活HPI轴，同样优先驱动皮质酮的合成与释放。
与通过AVT或ACTH激活不同，手动应激诱发了以皮质醇为主的反应
对动物进行模拟搬运和处理的手动应激后，血浆皮质醇和皮质酮水平均升高，但峰值出现在应激后5小时。与药理学刺激相反，在绝对水平和变化倍数上，皮质醇的升高都显著高于皮质酮，表明在手动应激条件下，皮质醇成为了主导的释放激素。值得注意的是，当在手动应激前使用黑色素皮质素2型受体拮抗剂抑制ACTH受体功能时，皮质酮的升高被完全阻断，而皮质醇的升高不受影响。这提示皮质酮的释放严格依赖于经典的HPI轴（ACTH-MCR2通路），而皮质醇的释放至少部分通过不依赖ACTH的机制调控。
截肢损伤增加了皮质醇和皮质酮水平
在截肢损伤模型中，两种激素的血浆水平再次升高。皮质酮在损伤后10分钟即显著升高，并在1小时达到峰值，其升高幅度（16倍）远大于皮质醇（3.8倍）。这表明，对于损伤这种特定应激，皮质酮同样是主导的应答激素，且其反应更为迅速。
体外肾上腺组织孵育确定了皮质醇和皮质酮合成与释放的不同机制
离体肾上腺组织孵育实验进一步揭示了两种激素调控的差异。乙酰胆碱能强烈刺激皮质醇的释放（进入培养基），但对皮质酮的合成与释放无影响。相反，AVT和ACTH能有效刺激皮质酮的合成与释放，但对皮质醇释放的刺激作用弱于ACh。肾上腺素也能刺激皮质酮的合成。这些结果支持了皮质醇的释放可能由交感神经末梢释放的ACh直接调控的假说，而皮质酮的调控则更依赖于经典的HPI轴通路。
Axolotl肾上腺包含异质性的GC产生细胞群
通过HCR原位杂交对肾上腺组织进行分析，发现表达类固醇合成关键酶CYP11β1的细胞群体具有异质性。大多数细胞同时高表达皮质醇合成关键酶CYP17和ACTH受体MCR2。但也存在一些亚群，例如高表达CYP17但低表达或不表达MCR2的细胞，这些细胞可能代表了不依赖ACTH的皮质醇产生细胞；以及低表达或不表达CYP17但高表达MCR2的细胞，这些细胞可能主要产生皮质酮。这种细胞异质性为两种激素的独立调控提供了可能的解剖学基础。
在静脉注射皮质醇和皮质酮后，只有皮质醇降低了骨骼肌和肝脏中的葡萄糖摄取
通过PET成像监测葡萄糖类似物18F-FDG的摄取发现，静脉注射皮质醇能显著降低骨骼肌和肝脏对葡萄糖的摄取，这是糖皮质激素的经典生理效应之一。而注射同等剂量的皮质酮则未产生此效应。在血糖测量中，无论是注射ACTH、皮质醇还是皮质酮，都能引起血糖升高，但皮质醇的升血糖效应更为显著。这表明，在介导某些下游生理效应（如抑制外周葡萄糖摄取）方面，皮质醇比皮质酮具有更强的效力。
研究结论与意义
本研究系统性地描绘了墨西哥钝口螈复杂且出乎意料的肾上腺应激反应图谱。核心结论是：墨西哥钝口螈同时利用皮质醇和皮质酮这两种糖皮质激素，但它们在不同应激条件下占主导地位，并受到不同机制的调控。具体而言：1) 当通过经典的HPI轴通路（由AVT或ACTH激活）激活时，皮质酮是主导的激素。2) 在手动应激以及乙酰胆碱直接刺激下，皮质醇的释放更为突出，提示存在一种涉及交感神经信号传导的替代机制。3) 在应对截肢损伤时，两种激素均增加，但皮质酮占主导，表现为一种损伤特异性反应。4) 在直接介导经典的糖皮质激素信号生理效应（如抑制外周组织葡萄糖摄取）时，皮质醇的效力更强。
基于这些发现，研究者提出了一个新颖的假说：axolotl可能依赖皮质醇作为其主导的糖皮质激素，其功能部分上作为儿茶酚胺系统的延伸；相比之下，皮质酮则主要通过经典的下丘脑-垂体-肾间轴进行调控。 这项研究具有多重重要意义：首先，它明确了在axolotl研究中测量哪种（或两种）糖皮质激素的困惑，为未来将应激评估纳入axolotl的发育、环境、再生和转化医学研究提供了至关重要的方法学依据和具体建议。其次，它揭示了应激反应在再生模型中的复杂性和特异性，特别是损伤与一般性应激可能通过不同的激素动力学来影响再生过程，这为理解应激如何调控（通常是抑制）再生能力开辟了新的研究方向。最后，该研究增进了我们对脊椎动物应激内分泌学进化与多样性的理解，挑战了“两栖动物以皮质酮为主导”的简单概括，展示了即使是近缘物种，其应激系统的调控也可能存在显著差异。
