《Phytomedicine》：Flavonoid GL-V9 as a Novel and Potent Acetyl-CoA Carboxylase 1 Inhibitor Confers Cisplatin Hypersensitivity in Ovarian Cancer
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为克服卵巢癌(OC)对顺铂的获得性耐药，本研究探究了源自黄芩的类黄酮化合物GL-V9的增敏作用及其机制。研究发现，GL-V9是一种新型高效的乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)抑制剂，其通过靶向ACC1催化结构域，抑制其活性，导致细胞内活性氧(ROS)水平升高，从而增强顺铂敏感性并逆转耐药性。这为临床转化提供了一种潜力新策略。
卵巢癌是女性生殖系统中最致命的恶性肿瘤之一。自上世纪70年代顺铂应用于临床以来，以铂类药物为基础的联合化疗一直是其一线治疗的核心方案。然而，残酷的现实是，约70%的患者最终会经历疾病复发，并对铂类药物产生耐药性。一旦耐药形成，患者的治疗选择变得极为有限，客观缓解率低下，中位生存期通常不足12个月。这种“获得性耐药”成为卵巢癌治疗失败和患者死亡的主要原因，寻找能够有效克服耐药、增强化疗敏感性的新策略，是当前临床上面临的巨大挑战。
与此同时，科学家们逐渐认识到，肿瘤细胞的代谢重编程在其生长、存活和耐药中扮演着关键角色。其中，脂肪酸从头合成(FAS)的增强是许多癌细胞的共同特征，它能满足肿瘤快速增殖对生物膜构建、信号分子生成和能量供应的巨大需求。乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)正是这一代谢通路的限速酶，它将乙酰辅酶A催化为丙二酰辅酶A，为长链脂肪酸合成提供碳源。研究表明，ACC1在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中高表达，且与疾病恶性程度和不良预后相关。因此，靶向ACC1、抑制脂质合成，被认为是一种有潜力的抗肿瘤策略，但其在逆转卵巢癌顺铂耐药方面的具体作用和机制尚不明确。
基于此，中国药科大学的研究团队在《Phytomedicine》上发表了一项研究，聚焦于一种名为GL-V9的类黄酮化合物。GL-V9源自传统中药黄芩的有效成分汉黄芩素，经过理性的化学结构设计与优化，于2024年9月获准进入临床研究，是具有自主知识产权的1类抗肿瘤新药。先前的研究已揭示其在结肠癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用，但其在卵巢癌，特别是克服顺铂耐药方面的潜力尚未可知。本研究旨在评估GL-V9在卵巢癌中的抗肿瘤效果，阐明其作用机制，并探究其与顺铂联用、克服耐药性的潜力，为临床提供新的治疗思路。
为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。在机制探索层面，通过生物素下拉(Sreptavidin pull-down)结合Western blot验证了GL-V9与靶蛋白的直接结合；利用微尺度热泳(MST)和细胞热转移分析(CETSA)测定了其结合亲和力与靶点结合引起的蛋白热稳定性变化；通过分子对接模拟了结合位点，并构建催化结构域缺失突变体进行了功能验证。在功能学验证上，采用了细胞活力(MTT)、克隆形成、细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI染色)等实验评估药物的抗增殖和促凋亡效应，并使用ACC酶活性试剂盒和流式细胞术检测了药物对酶活性和细胞内活性氧(ROS)水平的影响。在靶点与疾病的关联性分析中，研究者利用了公共数据库的转录组数据(GSE54388)和单细胞RNA测序数据(GSE184880, GSE303696)分析ACC1在卵巢癌组织中的表达及其与化疗的关系，并通过对临床样本的Western blot和免疫组化(IHC)进行了验证。最终的体内药效学评价则在A2780卵巢癌（包括顺铂敏感和顺铂耐药细胞系）的裸鼠皮下移植瘤模型中进行，评估了GL-V9单药及与顺铂联用的抗肿瘤效果和安全性。
研究结果
GL-V9对多种卵巢癌细胞系具有广泛的细胞毒性活性
研究人员首先在五种卵巢癌细胞系(A2780, OVCAR-433, KGN, SKOV-3, HEY)中评估了GL-V9的作用。结果显示，GL-V9能显著抑制所有测试细胞系的克隆形成，并表现出强大的生长抑制效应。进一步选择A2780和KGN细胞进行机制研究，发现GL-V9处理可显著增加细胞凋亡比例，并上调凋亡关键蛋白Cleaved Caspase-3的水平，表明其通过诱导细胞凋亡发挥广泛的细胞毒作用。
GL-V9通过靶向其催化位点发挥ACC1抑制剂作用，并与ACC2具有结合亲和力
为阐明GL-V9的直接作用靶点，研究人员合成了其生物素偶联物(Biotin-GL-V9)。下拉实验证实GL-V9可直接与ACC1和ACC2结合。鉴于ACC1在细胞质中调控脂肪酸从头合成的核心作用，后续研究聚焦于GL-V9与ACC1的相互作用。MST和CETSA实验进一步证实了GL-V9与ACC1的剂量依赖性结合。分子对接模拟发现GL-V9结合在ACC1催化结构域（残基1350附近）。通过构建催化结构域缺失突变体(Δ1100-1600)并进行下拉实验，发现GL-V9与该突变体的结合几乎完全丧失，从而在功能上确认了GL-V9特异性靶向ACC1的催化结构域。
GL-V9有效抑制ACC1的酶活性
基因本体(GO)富集分析提示，脂肪酸代谢通路在顺铂处理后发生显著改变。ACC酶活性检测显示，GL-V9能显著抑制卵巢癌细胞中ACC的酶活性。值得注意的是，GL-V9处理并不改变ACC1的蛋白表达水平，说明其是通过占据活性位点来抑制ACC1的功能，而非影响其表达。进一步检测细胞脂肪酸含量发现，GL-V9处理可显著降低多种长链脂肪酸（如亚麻酸、花生四烯酸）和短链脂肪酸（如丙酸）的水平。这表明GL-V9通过靶向抑制ACC1活性，耗竭细胞脂肪酸库，从而损害卵巢癌细胞的生存。
ACC1在卵巢癌组织中表达显著高于正常卵巢组织
转录组分析、单细胞RNA测序数据、免疫组化染色以及临床样本的Western blot分析一致证实，ACC1在卵巢癌组织中的表达显著高于正常卵巢组织。单细胞分析进一步显示，ACC1的表达在上皮细胞中富集，尤其在恶性的上皮细胞簇中，并在肿瘤演进过程中呈现动态变化。对公共数据集的分析还发现，顺铂治疗后卵巢癌样本中ACC1表达进一步上调，提示化疗压力下脂质代谢通路被激活。生存分析显示，ACC1高表达与卵巢癌患者较差的总生存期显著相关。功能上，敲低ACC1可抑制卵巢癌细胞生长，且敲低ACC1后，GL-V9的细胞毒性作用显著减弱，这与GL-V9通过靶向ACC1发挥作用的结论相符。
GL-V9通过促进细胞内活性氧积累增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性
敲低ACC1可显著增加A2780细胞对顺铂的敏感性。联合用药实验表明，GL-V9与顺铂在A2780和KGN细胞中具有强协同效应，能显著增强顺铂的治疗效果。这种增敏效应在敲低ACC1的细胞中得以复现。机制上，敲低ACC1联合顺铂处理，或GL-V9与顺铂联用，均可显著增加细胞凋亡、Cleaved Caspase-3水平以及细胞内活性氧(ROS)水平。这表明GL-V9通过靶向ACC1、升高细胞内ROS水平，从而增强顺铂的化疗敏感性和治疗效果。
GL-V9通过促进细胞内活性氧积累恢复耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性
对单细胞测序数据集(GSE303696)的分析显示，顺铂处理后卵巢癌样本中ACC1表达显著上调。免疫组化也证实ACC1在顺铂耐药的卵巢癌组织中蛋白水平更高。在顺铂耐药的A2780-cisR细胞中，GL-V9能显著增强细胞对顺铂的敏感性，两者表现出强协同效应，并能有效逆转顺铂耐药。敲低ACC1可复现此增敏效果。与在敏感细胞中的发现一致，GL-V9与顺铂联用可显著增加A2780-cisR细胞的凋亡、Cleaved Caspase-3水平以及细胞内ROS水平。这证明GL-V9同样能通过促进ROS积累，有效逆转卵巢癌的顺铂耐药。
log2(1.5) and P < 0.05. ACC1 is highlighted among the significantly upregulated genes. (B) Immunohistochemistry (IHC) staining and quantitative analysis of ACC1 expression in cisplatin-sensitive versus cisplatin-resistant ovarian cancer tissue sections (n=5). Statistical significance is denoted as *P < 0.05, **P < 0.01, *P < 0.001, and n.s. (not significant), assessed by one-way ANOVA. (C) Cell viability curves of A2780-cisR cells treated with the indicated concentrations of cisplatin in combination with 5 μM GL-V9 for 24 hours. (D) Bliss synergy analysis of A2780-cisR cells treated with varying concentrations of GL-V9 and cisplatin for 24 hours. Cell viability was assessed by MTT assay. (E) Colony formation of A2780 and A2780-cisR cells following 10-day treatment with cisplatin (0.5 μg/mL). (F) Colony formation of A2780-cisR cells after 10-day treatment with cisplatin (0.5 μg/mL) or GL-V9 (1 μM). (G) Colony formation of A2780-cisR wild-type (WT) and ACC1 knockout (KO) cells after 10-day treatment with cisplatin (0.5 μg/mL). (H) Apoptosis detection by Annexin V-FITC/PI dual staining in A2780-cisR cells treated with cisplatin (40 μM) or GL-V9 (5 μM) for 12 hours. (I) Western Blot analysis of Cleaved Caspase-3 levels in A2780-cisR cells treated with cisplatin (40 μM) or GL-V9 (5 μM) for 24 hours. (J) Flow cytometry analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in A2780-cisR cells treated with GL-V9 (5 μM), cisplatin (40 μM), or their combination for 24 hours.">
GL-V9在体内有效增强顺铂化疗敏感性并逆转顺铂耐药
在A2780亲本细胞和顺铂耐药A2780-cisR细胞构建的裸鼠皮下移植瘤模型中，体内实验验证了上述发现。与顺铂单药治疗组相比，GL-V9与顺铂联合治疗能显著抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积和重量。肿瘤组织的免疫组化分析显示，联合治疗组肿瘤的增殖标记物Ki67表达降低，而凋亡标记物Cleaved Caspase-3表达升高。从肿瘤组织中提取蛋白进行ACC酶活性检测，证实GL-V9治疗（无论是单药还是联合用药）均能显著抑制肿瘤内的ACC活性。血清生化分析表明，联合用药并未显著增加顺铂引起的肝毒性和肾毒性。这些结果在体内证实了GL-V9能有效增敏顺铂并逆转耐药，且具有良好安全性。
研究结论与意义
本研究系统性地鉴定并验证了源自黄芩的类黄酮衍生物GL-V9作为一种新型、高效、特异的乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)抑制剂。其通过与ACC1催化结构域结合，直接抑制该酶的活性，导致卵巢癌细胞脂肪酸合成受阻、细胞内活性氧(ROS)水平升高，最终诱导细胞凋亡并抑制增殖。
更为重要的是，该研究为解决卵巢癌临床治疗中的核心难题——顺铂耐药，提供了创新的解决方案和明确的分子机制。研究发现，ACC1在卵巢癌组织中高表达，且其表达在化疗压力下进一步上调，与患者不良预后相关。GL-V9通过靶向抑制ACC1，不仅能发挥单药抗肿瘤作用，更能与顺铂产生强效协同，显著增强顺铂对敏感癌细胞的杀伤力，并有效逆转耐药细胞对顺铂的抵抗。其核心机制在于ACC1抑制导致的ROS爆发，打破了癌细胞的氧化还原平衡和能量稳态，从而放大了顺铂的细胞毒性效应。
这项研究的重要意义在于：首先，从“代谢干预”角度为克服卵巢癌化疗耐药提供了新的靶点和策略，证实靶向脂质合成限速酶ACC1是一条可行之路。其次，明确揭示了GL-V9这一具有中国自主知识产权、已进入临床研究阶段的创新药物的新作用机制和临床应用潜力，为其与铂类药物联用以改善卵巢癌患者预后，特别是治疗铂耐药复发患者，提供了坚实的临床前依据。最后，研究整合了多组学数据分析、多种分子互作验证技术以及体内外功能模型，完整地勾勒出“药物-靶点-通路-表型”的作用链条，为后续相关研究和药物开发提供了范本。综上所述，GL-V9有望成为一种具有临床转化前景的ACC1靶向治疗药物，为克服卵巢癌顺铂耐药这一临床困境带来新的希望。
