《Plant Gene》：Activity of transgenically expressed maize defensive genes and proteins against the biotrophic maize pathogen
Ustilago maydis
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玉米抗病基因在生物真菌Ustilago maydis中的有效性研究。转基因悬浮培养物中，chitinase A、defensin、E2F2-1、maizewin和metallothionein显著抑制病原菌生长，而chalcone isomerase 3基因则促进生长。该研究揭示了部分抗坏死性病原的基因对生物性病原也存在交叉保护效应，为开发广谱抗病玉米提供理论依据。
帕特里克·F·道德（Patrick F. Dowd）| 托德·A·诺伊曼（Todd A. Naumann）| 埃里克·T·约翰逊（Eric T. Johnson）
美国农业部（USDA），农业研究服务局（Agricultural Research Service），国家农业利用研究中心（National Center for Agricultural Utilization Research），作物生物保护研究组（Crop Bioprotection Research Unit），地址：美国伊利诺伊州皮奥里亚市大学街北1815号（1815 N. University St., Peoria, IL 61614, USA）
摘要
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，但其产量受到多种疾病的限制，其中一些疾病会导致毒素在谷物中积累。一些研究已经鉴定并验证了针对坏死性病原真菌的潜在玉米抗性基因，但针对生物性病原真菌的抗性基因尚未得到充分研究。先前有研究表明，能够持续表达多种玉米基因的转基因愈伤组织对昆虫和坏死性镰刀菌（Fusarium）具有抗性。在本研究中，评估了这种愈伤组织对生物性玉米病原菌——玉米黑穗菌（Ustilago maydis）的抗性。含有几丁质酶A和几丁质酶2、防御素、E2F2、香叶基香叶基转移酶、水解酶、maizewin和金属硫蛋白基因的愈伤组织显著抑制了玉米黑穗菌的生长。而含有查尔酮异构酶3基因的愈伤组织则促进了玉米黑穗菌的生长，这可能与之前发现的茉莉酸防御途径的诱导有关。此外，异源表达并纯化的几丁质酶A、玉米水解酶、maizewin和金属硫蛋白在添加到冻干培养基平板上（浓度为1000 ppm或更低）时也能抑制玉米黑穗菌的生长。本研究表明，某些基因对生物性和坏死性玉米病原菌均具有抗性，但有时赋予对坏死性病原菌抗性的基因反而会增加对生物性病原菌的敏感性。这些信息将有助于开发出更抗病的玉米品种，从而为种植者、最终用户和消费者带来更可持续的生产效益。
引言
随着人类人口的不断增长，对食品生产的需求也在增加。玉米是全球主要的粮食作物之一（Erenstein等人，2022年）。玉米被用于人类食物、动物饲料和乙醇生产，这对其可持续生产提出了更高要求。玉米的生产受到多种疾病的限制（Savary等人，2019年），这些疾病会影响玉米幼苗、根系、茎秆、叶片和成熟籽粒（White，1999年）。某些真菌会侵袭玉米籽粒，并导致毒素在其内部积累（Payne，1999年）。
许多真菌疾病采用坏死性生活策略，通过杀死细胞后进行摄食。玉米的坏死性病原真菌包括某些镰刀菌（Fusarium）菌株、灰叶斑病（Cercospora zeae-maydis）和南方玉米叶枯病（Cochliobolus heterostrophus）（Zhu等人，2021年）。而采用生物性生活策略的玉米真菌疾病包括煤斑病（Phyllachora maydis）（Valle-Torres等人，2020年）、霜霉病（Peronosclerospora）（Crouch等人，2022年）、锈病（Puccinia）和黑穗病（Ustilago maydis）（Zhu等人，2021年）。煤斑病长期以来一直是南美洲、中美洲部分地区及其周边岛屿的主要病害，最近在美国和加拿大的中西部玉米种植区也成为了极具破坏性的病害（Rocco da Silva等人，2021年）。虽然实验室可以很容易地生成用于评估对坏死性真菌抗性的繁殖体，但几乎所有生物性真菌都无法通过这种方式获得。尽管使用抗性杂交品种可以减少玉米黑穗菌造成的经济损失（Pataky，1999年），但在某些情况下损失仍可能非常严重（Earecho和Gabrekiristos，2024年）。然而，玉米黑穗菌会经历一个可培养的单倍体腐生酵母生长阶段，这使其成为研究生物性真菌生物学的有用模型（Brefort等人，2009年）。这一特性也有助于确定哪些抗性分子可能对生物性真菌有效。
先前的研究利用转基因玉米愈伤组织鉴定出几种新的抗性基因，这些基因通常也具有抗虫性（例如Dowd和Johnson，2018年；Dowd等人，2020年；Dowd等人，2023年）。这些研究还经常包括直接测试从酵母中纯化的由相同抗性基因编码的蛋白质，其抗真菌活性支持了愈伤组织实验的结果（例如Dowd等人，2019a；Dowd等人，2020年；Dowd等人，2023年）。这些研究中研究的基因编码了多种类型的蛋白质，包括水解酶、调节蛋白和复合蛋白。为了探究这些基因是否也能增强对代表性生物性病原菌——玉米黑穗菌的抗性，研究人员进行了类似针对镰刀菌的研究。含有这些抗性基因及其相应异源蛋白的愈伤组织被用来检测其对玉米黑穗菌的抗性，以确定哪些基因对这种生物性病原菌也有效，从而更好地理解抗性机制，并识别出在广谱抗虫性中最有价值的基因。与其他生物性真菌一样，玉米黑穗菌也会产生干扰玉米防御反应的效应分子（Brefort等人，2009年）。因此，识别能够持续产生并抵御这种真菌的基因具有额外价值。
真菌的来源与培养
真菌的来源与培养
从伊利诺伊州种植的玉米中分离出两种玉米黑穗菌（Ustilago maydis）菌株，分别命名为NRRL YB255和YB380，这些菌株来自美国农业部农业研究服务局（USDA）位于伊利诺伊州皮奥里亚的NRRL培养收集中心（NRRL Culture Collection）。这些菌株在含有酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨和葡萄糖的琼脂培养基（配方：3克酵母提取物、3克麦芽提取物、5克蛋白胨、10克葡萄糖、15克琼脂，1升水中）上，于25°C条件下培养。将培养2天的菌落从培养皿上刮下后，用0.01%的Triton X-100稀释。通过稀释平板法来测定活菌数量。
转基因愈伤组织的抗性检测
大多数经过改造、含有先前鉴定出的抗真菌玉米基因的愈伤组织显著抑制了两种玉米黑穗菌菌株的生长，这一点从菌丝生长宽度与对照组的差异中可以看出（见表2）。具体而言，防御素（例如试验2中GUS对照组为2.5 ± 0.2，N = 6；防御素处理组为0.3 ± 0.2，N = 6，P < 0.0001）、E2F2–1（例如试验1中GUS对照组为4.4 ± 0.2，N = 6；E2F2–1处理组为2.3 ± 0.3，N = 6，P = 0.0010）以及金属硫蛋白（例如试验1中……）都表现出显著的抗性效果。
讨论
以往关于玉米黑穗菌的研究主要集中在感染和肿瘤形成过程上，但也有一些关于玉米防御反应的研究。多项研究使用不同的方法检测了潜在的抗性基因。以下讨论将这些例子按功能分类，尽管在某些情况下，生物活性蛋白可能具有多种功能。
结论
本研究表明，许多既能增强对毛虫抗性又能抵抗坏死性真菌（如镰刀菌）的玉米防御基因，同样也有助于提高对代表性生物性病原菌——玉米黑穗菌的抗性。然而，有一个例外情况表明，某些抗性基因可能会间接降低抑制生物性真菌的抗性因子。这些信息将有助于更快地开发出更有效的抗病玉米品种，从而惠及种植者、最终用户和消费者。
作者贡献声明
帕特里克·F·道德（Patrick F. Dowd）：负责撰写、审稿和编辑，撰写初稿，方法学设计，实验实施，数据分析，概念构建。
托德·A·诺伊曼（Todd A. Naumann）：负责撰写、审稿和编辑，方法学设计，实验实施。
埃里克·T·约翰逊（Eric T. Johnson）：负责撰写、审稿和编辑，方法学设计，实验实施。
免责声明
手稿中提到的公司名称或产品并不表示美国农业部（USDA）对其优于未提及的其他公司的类似产品进行推荐或认可。美国农业部是一个平等机会的雇主。
资金来源
本工作得到了美国农业部（U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service）的支持。本研究未接受来自公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。
致谢
我们感谢E. Grotewald提供初始的BMS细胞培养物，美国农业部农业研究服务局NRRL培养收集中心提供玉米黑穗菌菌株，M. Doehring、D. Lee和K. Sollenberger提供技术支持，以及E. J. Muturi、M. M. Vaughan和T. J. Ward对手稿初稿的修改意见。
