通过激活ROS清除基因来减少ROS积累，从而鉴定参与菠萝果实内部褐变的AcbHLH82蛋白

《Postharvest Biology and Technology》：Identification of AcbHLH82 involved in internal browning of pineapple fruit by reducing ROS accumulation via activation of ROS scavenging genes

本研究发现低温储存通过激活转录因子AcbHLH82及其下游抗氧化基因（AcAPX1、AcPOD1、AcPOD30），降低活性氧（ROS）积累，从而缓解龙眼内部褐变，为保鲜策略提供理论依据。

　　

杨明哲|谭雅涵|谭英英|魏伟|洪克谦|陈建业

中国华南农业大学园艺学院，教育部南方园艺产品保鲜工程技术研究中心，广东省果树蔬菜采后科学重点实验室，广州510642

摘要

为了阐明转录因子（TFs）在低温缓解菠萝内部褐变（IB）过程中调节活性氧（ROS）代谢的分子机制，研究了在10°C（低温）和25°C下储存的‘Comte de Paris’菠萝果实中ROS积累的变化以及TF介导的ROS清除基因的调控，重点关注基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子。在10°C下储存的果实中，丙二醛（MDA）、过氧化氢（H?O?）和超氧阴离子（O?^•–）的水平以及IB程度均低于25°C下储存的果实。基于加权基因共表达网络分析（WGCNA）和转录组测序数据的K-means聚类，发现低温诱导的AcbHLH82是一种与IB发展过程中ROS积累呈负相关的转录因子。电泳迁移率改变实验和双荧光素酶报告基因分析表明，AcbHLH82通过特异性识别E-box顺式元件（CANNTG）直接激活了AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30等ROS清除基因的转录，从而增强了ROS清除能力。在菠萝果肉中短暂过表达或沉默AcbHLH82后，发现AcbHLH82表达升高能有效减少IB，同时ROS清除基因的表达增加，H?O?和O?^•–的水平也降低。这些结果揭示了低温储存通过AcbHLH82依赖的ROS清除基因激活增强抗氧化清除能力来缓解IB的分子基础。

引言

菠萝（Ananas comosus L.）是一种具有独特风味和营养价值的重要热带和亚热带水果，在经济和工业上具有重要意义。然而，在采后储存过程中，它容易发生内部褐变（IB）这一生理障碍，这会显著影响果实的质量和食用性（Ali等人，2020年；Zhang等人，2016年；Hou等人，2022年）。活性氧（ROS）、多酚氧化酶（PPO）和酚类底物被认为是导致IB的主要因素。虽然PPO和酚类底物驱动的IB的分子机制已得到广泛研究（Li等人，2023年；Lai等人，2024年），但ROS驱动的IB的分子基础仍不够清楚。

ROS在植物生长、发育以及对生物和非生物胁迫的响应中起着关键作用。线粒体作为ROS生成的主要场所，对于维持细胞氧化还原平衡至关重要（Blokhina和Fagerstedt，2010年；Sachdev等人，2021年；Sood，2025年）。然而，过量的ROS会产生有毒分子如过氧化氢（H?O?）和超氧阴离子（O?^•–），导致线粒体蛋白质氧化损伤。这种损伤会破坏线粒体结构和功能，进一步加剧氧化还原失衡和ROS积累，最终加速衰老（Hasanuzzaman等人，2020年；Meitha等人，2020年；Huang等人，2021年）。果实衰老是一个氧化过程，伴随着ROS的显著增加，尤其是O?^•–和H?O?（Tian等人，2013年），这会加速细胞老化，降低储存潜力，并损害果实品质，这一现象在油桃（Wang等人，2015年）、龙眼（Lin等人，2021年）和猕猴桃（Eh等人，2024年）中也有报道。

转录因子（TFs）是植物在非生物胁迫下生长和发育的核心调节因子，通过激活多种途径在不同水平上调节和减轻胁迫引起的损伤（Carretero-Paulet等人，2010年）。基本螺旋-环-螺旋（bHLH）家族是植物中最重要的转录因子群体之一（Pires和Dolan，2010年），参与多种生物过程，包括生长、发育以及对寒冷（Zhao等人，2018年）、干旱和盐碱（Ji等人，2016年）等环境胁迫的响应。越来越多的证据表明，bHLH转录因子通过调节ROS清除基因（如过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）等ROS解毒成分的基因来参与抗氧化防御。例如，在小麦中过表达TabHLH1可以增加POD、SOD和过氧化氢酶（CAT）的活性，从而减少ROS积累（Yang等人，2016年）。在烟草中，过表达MdbHLH130可以通过增强ROS清除酶的活性来降低干旱胁迫下的ROS水平（Zhao等人，2020年）。在拟南芥中，过表达CabHLH035可以通过增加SOD、POD和APX的活性来提高耐寒性（Zhang等人，2024年）。最近，So等人（2025年）和Li等人（2025年）报告称，在百合中过表达LpbHLH144以及在Populus davidiana中过表达PdbUNE12可以通过增加关键抗氧化酶的活性来提高耐盐性。重要的是，大量证据表明，bHLH转录因子通过直接结合G/E-box元件来激活下游靶基因。在三叶橙（Poncirus trifoliata中，PtrbHLH直接结合POD启动子中的E-box元件来激活其表达，从而增强抗氧化能力和耐寒性（Huang等人，2013年）。在花生（Arachis hypogaea中，AhbHLH121通过直接结合其启动子中的G/E-box元件来激活AhPOD、AhCAT和AhSOD，从而提高耐盐性（Zhao等人，2024年）。在盐胁迫下的杨树中，PagbHLH35通过结合PagPOD和PagSOD启动子中的G/E-box元件来增加POD和SOD的活性（Wang等人，2024年）。总体而言，这些研究表明bHLH转录因子通过直接调节抗氧化酶基因来增强植物的抗逆性。

低温（≤10°C）（LT）可以维持氧化还原平衡，延缓ROS积累（Nadarajah，2020年），并抑制H?O?和O?^•–的增加，从而延缓菠萝的IB发生（Zhang等人，2015年）。因此，维持ROS的稳态对于延长菠萝果实的采后储存寿命至关重要。然而，低温缓解IB过程中调控ROS稳态的转录调控机制仍大部分未被探索。在本研究中，应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对包括丙二醛（MDA）、H?O?和O?^•–含量在内的表型指标以及与LT缓解IB相关的差异表达基因（DEGs）进行了分析。发现AcbHLH82是一种负调控ROS积累的转录因子，同时它还调控三种ROS清除基因AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30。通过电泳迁移率改变实验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验（DLR）评估了AcbHLH82对AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30的转录调控作用。此外，短暂过表达和沉默实验进一步验证了AcbHLH82在调节菠萝果实IB发展相关ROS代谢中的作用。本研究加深了对AcbHLH82在菠萝储存过程中介导的调控网络的理解，并为开发保持易褐变果实品质的采后保存策略提供了分子依据。

实验材料和处理

2024年12月，从中国湛江的一个果园获取了处于商业成熟度70%（开花后18周）的‘Comte de Paris’菠萝果实。所有果实均在收获后2小时内运送到实验室。选择了无机械损伤、大小均匀、每果重约1.6公斤且无可见病害的果实。大约400个菠萝果实被随机分为两组，每组200个。

IB发展、ROS积累和线粒体结构变化的分析

如图1A所示，在储存期间，LT组和RT组之间的IB有明显差异。LT组的果实在整个11天的储存期间几乎没有可见的IB，而RT组的果实从第5天开始出现轻微褐变，并随着储存时间的延长而逐渐加剧。继续储存后，RT组的IB指数在第5天后急剧增加，在第11天达到2，而LT组则从第9天开始明显增加。

讨论

IB是菠萝果实中的一个主要生理障碍，严重限制了产业的发展并造成了巨大的经济损失（Zhang等人，2015年；Zhang等人，2016年；Hou等人，2022年）。在我们之前的研究中，低温（10°C）储存可以延缓菠萝果实的IB发展（Hong等人，2023年）。为了阐明在这种条件下的IB耐受性的分子基础，本研究进行了生理、细胞和分子分析。

结论

本研究探讨了在10°C下储存‘Comte de Paris’菠萝过程中与IB发展相关的ROS代谢的分子机制。在该温度下储存可以保持线粒体完整性，并降低H?O?、O?^•–和IB的严重程度。基于转录组测序数据的WGCNA和K-means聚类分析，发现bHLH转录因子AcbHLH82是IB耐受性的正向调节因子。AcbHLH82通过激活AcAPX1的转录来发挥作用。

作者声明

洪克谦和陈建业设计了实验；杨明哲完成了大部分实验并分析了数据；谭雅涵、谭英英和魏伟参与了一些实验；杨明哲、洪克谦和陈建业撰写了手稿；洪克谦和陈建业提供了建议并修订了手稿。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。

CRediT作者贡献声明

谭雅涵：实验研究。谭英英：数据整理。杨明哲：初稿撰写和数据整理。陈建业：审稿和编辑，监督。魏伟：正式分析。洪克谦：初稿撰写。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32460790）和广东省基础与应用基础研究基金（资助编号：2025A1515012724）的支持。