《Poultry Science》：Effects of short fasting periods and recovery diet protein level on molting response and postmolt productivity in aged laying hens
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柑橘采后病害中潜伏感染真菌群落动态及致病机制研究表明，预采收阶段真菌α多样性较高，β多样性变化显著，储存后核心微生物减少，Alternaria、Fusarium和Colletotrichum等病原菌丰度增加引发主要病害，同时有益微生物下降。研究通过ITS测序揭示采前至采后微生物网络稳定性差异，为潜伏感染病害防控提供新思路。
陈江华|徐梦婷|朱婷|杨子怡|刘娟|段杰|林阳|余晓|江道宏|傅艳萍
湖北省植物病理学重点实验室，华中农业大学，武汉430070，中国
摘要
除了与伤口相关的感染（如绿霉病、蓝霉病和酸腐病）之外，潜伏性感染是柑橘类水果（Citrus unshiu）最常见的采后病害类型。这些病害特别难以控制，其潜在的致病机制也尚未得到充分研究。在本研究中，我们使用ITS测序技术监测了从采前发育到储存期间柑橘果实中微生物群落的动态变化。β多样性分析显示真菌群落组成发生了显著变化。值得注意的是，在采前发育阶段观察到了更大的变异性，而采后样本的变异性相对较小。微生物相互作用网络和LEfSe分析进一步表明，采前样本中的微生物网络更为稳定。此外，与采前阶段相比，储存期间核心微生物的数量明显减少。对采后病害的调查发现，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum属真菌引起的腐烂病是主要病害，且病害发生率与Alternaria和Colletotrichum的数量呈正相关。同时，采后有益微生物的数量显著下降。因此，有益微生物的减少以及潜在致病真菌的增加可能在柑橘果实采后病害的发生中起着重要作用。本研究为理解潜伏性感染的致病机制提供了理论基础，并为控制这些病害提供了新的思路。
引言
潜伏性感染的特点是病原体在宿主体内长期存在而不引发明显的疾病或大量复制。在这一潜伏阶段，病原体保持休眠或静止状态，通常表现出最低的基因表达，以逃避宿主免疫系统的检测和清除。许多采后病害的发生与潜伏性感染直接相关。典型的例子包括柑橘和芒果的茎端腐烂、香蕉的炭疽病（Hu等人，2012年；Deng和Ceng，2008年）、仁果类水果（苹果和梨）的黑斑病和核霉病、核果类水果（桃子）的褐腐病、浆果（葡萄）的灰霉病、甜瓜的白霉病、辣椒的果实腐烂以及土豆的干腐病（Adaskaveg等人，2000年；Gell等人，2008年；Yin等人，2010年）。
研究表明，潜伏性感染性病原体在果实生长期间通过感染进入果实。潜伏性感染的一个典型特征是病原体在进入宿主后很长一段时间内保持不活跃状态。只有在有利条件下才会变得活跃并引发症状，最终导致病害爆发（Prusky，1996年）。例如，Diplodia属、Phomopsis mangiferae、Cytosphaera mangiferae和Pestalotiopsis属真菌会定殖在芒果的花序组织中（Johnson等人，1992年）。花序和花梗组织的内源性定殖是果实成熟过程中导致茎端腐烂的主要机制（Johnson等人，1992年）。Nair和Parker（1985年）以及Pezet等人（2003年）的观察表明，Botrytis cinerea会感染花器官和未成熟的果实，在坏死的花器官中保持半休眠状态或在葡萄发育过程中保持休眠状态。此外，B. cinerea主要存在于新鲜食用的葡萄的果柄中，而在叶片或果实表面的存在量相对较低（Holz等人，2003年）。同时，Alternaria可以直接穿透杏子和芒果的角质层或气孔，从而在果实中潜伏（Larsen等人，1980年；Prusky，1983年）。类似地，Colletotrichum gloeosporioides会在成熟的蓝莓上形成附着物，然后进入潜伏期（Hartung，1981年）。
柑橘果实腐烂是采后运输和储存期间常见的病害，严重威胁着中国乃至全球的柑橘产业。通常，腐烂率为20–30%，有时甚至高达50%，造成严重的采后经济损失（Salunkhe等人，1991年）。在柑橘类水果中，潜伏性感染病害是最普遍的采后问题，包括炭疽病（Colletotrichum属）、Diplodia茎端腐烂（Lasiodiplodia theobromae）、Diaporthe茎端腐烂（Diaporthe属）和Alternaria茎端腐烂（Alternaria citri）。这些病害每年导致了相当大的采后损失。
尽管已有大量研究关注果实上的病原体潜伏性感染，但关于潜伏性感染在宿主植物中引起的病害机制的研究仍然有限。这一空白不利于采后病害的科学控制。为了研究潜伏性感染引起的采后病害的机制，我们采用了高通量测序技术来分析柑橘果实在不同生长阶段的真菌群落组成变化，旨在探讨真菌对由潜伏性感染引起的柑橘果实采后病害的影响。
样本收集和DNA提取
2021年，我们从华中农业大学的一个果园收集了 Satsuma 柑橘（Citrus unshiu）的花朵和果实样本，采集时间包括：萌芽期（BP）、开花期（FP）、开花后30天（30DAF）、开花后150天（150DAF）、采后立即（0WAH）以及采后3周、6周和9周（3WAH、6WAH和9WAH）（图S1）。采后的果实被单独包装并储存在15°C以下。同时监测了病害发生情况。
真菌群落的α多样性和β多样性分析
使用Pielou均匀度指数、Shannon多样性指数和观察到的物种丰富度进行α多样性分析后发现，萌芽期（BP）、开花后150天（150DAF）以及所有采后样本的多样性、均匀度和丰富度均显著低于开花期（FP）和开花后30天（30DAF）的样本（p < 0.05）。然而，不同采后时间点之间没有显著差异（图1A-C）。
使用主坐标分析进行β多样性分析
讨论
柑橘的采后病害（不包括伤口感染）被归类为潜伏性感染；然而，这些感染的致病机制很少被报道。在本研究中，我们对采前和采后期间收集的柑橘果实样本进行了ITS测序，并进一步研究了采后病害以进行分析。研究结果表明，在不同生长阶段，柑橘果实中积累了不同的真菌。
结论
结论表明，柑橘果实的采前发育阶段具有更高的微生物多样性和更复杂、稳定的微生物网络。相比之下，采后的柑橘果实显示出较低的微生物变异性、脆弱的网络结构以及核心微生物数量的显著减少。此外，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum属真菌引起的果实腐烂是储存期间主要的采后病害。
作者声明
研究的构思与设计：陈江华和傅艳萍。数据获取、分析和解释：陈江华、徐梦婷、朱婷、杨子怡、刘娟、段杰。文章起草：陈江华和傅艳萍。重要内容的批判性修订：林阳、余晓和江道宏。最终版本审批：傅艳萍。
作者贡献声明
杨阳：验证、软件、方法学。 段杰：验证、调查。 刘娟：调查。 傅艳萍：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目协调、资金筹集、概念构思。 江道宏：写作——审稿与编辑、可视化、验证、方法学、数据管理。 余晓：验证、方法学、数据管理。 杨子怡：调查。 朱婷：调查。 徐梦婷：调查。 陈江华：利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢和资助
本工作得到了国家研发计划（2021YFD1600102）和CARS-26专项资金的支持。
