《Postharvest Biology and Technology》：Fruit firmness in Rosaceae: Mechanisms and genetic insights
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本文系统综述了蔷薇科果实硬度的调控网络，重点探讨了由细胞壁降解酶（如PG、PL、EXP、β-Gal等）及相关转录因子（NAC、MADS-box、WRKY等）构成的软化通路。文章不仅总结了当前知识，还评估了通过基因编辑（如CRISPR/Cas）精准改良果实硬度的可行性，旨在为育种项目提供有前景的分子靶点，以延长果实货架期。
2. 细胞壁的结构与组成
要理解果实软化，首先得从“骨架”开始——植物细胞壁。它可不是一堵简单的墙，而是一个由多种复杂多糖、结构蛋白和酚类化合物构成的精密三维网络。在蔷薇科果实的果肉中，细胞壁主要有三层：初生壁、胞间层和次生壁。次生壁木质化程度高，通常存在于木质部和纤维细胞中，在果肉中较为少见。真正决定果实强度和刚性的，是薄而有弹性的初生壁，以及富含果胶、位于细胞之间的胞间层。
构成细胞壁的多糖主要分为三类，它们共同决定了“骨架”的坚固与柔韧：
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纤维素：由β-1,4连接的葡萄糖残基组成的直链同聚糖。它像钢筋一样，形成长而稳定的微纤丝，是细胞壁的主要承重结构。
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半纤维素：一种由多种C5和C6糖组成的异聚糖，包括木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等。其中，木葡聚糖在蔷薇科果实的初生壁中广泛存在。它们像混凝土中的填料，与纤维素微纤丝交织在一起。
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果胶：这是胞间层和初生壁的关键组分，是“水泥”本身，将细胞彼此粘合。果胶结构非常多样复杂，包括线性同型半乳糖醛酸(HG)主链，以及分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)侧链。
在果实成熟过程中，细胞壁会动态改变其组成和结构。这个过程由一系列分泌到细胞壁空间的酶和蛋白质介导。这些“拆卸工人”协同工作，有序地“解构”细胞壁。例如，扩展蛋白(EXP)会“撬松”纤维素-半纤维素网络；木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶(XTH)负责降解半纤维素主链；β-半乳糖苷酶(β-Gal)负责移除果胶和半纤维素的侧链；果胶酯酶(PE)负责果胶的去乙酰化和去甲酯化；而聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶酸裂解酶(PL)则进一步降解暴露出来的果胶主链。这些酶的共同作用导致纤维素、半纤维素和果胶的解聚，果胶侧链中性糖的丢失，最终使得细胞粘附力下降，细胞间隙增大，细胞壁变薄、密度降低，果实也就变软了。
3. 纤维素与半纤维素的降解
3.1. 扩展蛋白(EXP)
EXP是一类非酶类的细胞壁蛋白，被认为是打破半纤维素与纤维素之间相互作用的“先锋”。它像一把“钥匙”，能松开纤维素和半纤维素之间的“锁扣”，使其更容易被后续的降解酶攻击，从而促进细胞壁松弛。在蔷薇科中，草莓的FaEXP2、FaEXP5，苹果的MdEXPA16/20，以及桃的PpEXP3等基因在果实成熟过程中表达量上升，与软化过程正相关。苹果的MdEXLB1在番茄中异位表达可促进番茄软化。此外，梨中的PbEXPB3b/4a表达升高与果皮微裂纹形成相关，表明EXP基因不仅影响果肉硬度，还可能影响果皮强度。不过，多数关于EXP基因的研究基于表达模式推断其功能，通过基因编辑等方法进行的功能验证仍然缺乏。
3.2. 内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)
EGase，也被称为纤维素酶，可能作用于纤维素-木葡聚糖网络，水解具有连续(1,4)-β-葡糖基残基的聚合物。在蔷薇科中，梨和草莓的EGase基因表达水平与软化同步上升。黑莓RuEG1或RuEG2在番茄中异位表达可促进软化。有趣的是，反向遗传学手段（如反义抑制）敲低草莓的EGase基因（FaEG1, FaEG3）对果实硬度几乎没有影响，这暗示单个基因的沉默可能不足以显著影响果实软化过程。在番茄中，同时敲除SlCel2和一个扩展蛋白基因SlExp1才能增强果实硬度，说明细胞壁降解是由多个基因协同作用控制的。
3.3. 木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶(XTH)
XTH编码的酶具有木葡聚糖内转葡糖基酶(XET)活性或木葡聚糖内水解酶(XEH)活性，它们在细胞壁松弛相关的发育过程（如果实软化）中起着重要作用。XEH不可逆地水解木葡聚糖聚合物，而XET则是非水解切割，但有时又能重新连接木葡聚糖链，参与细胞壁重塑。樱桃的PavXTH14/15、苹果的MdXTH3/25/26/28、桃的XTH33以及林丛草莓的FvXTH6/9等在果实发育和成熟过程中表达量大幅增加。其中PavXTH14/15、MdXTHB和FvXTH6/9的瞬时过表达被证实可促进果实软化。但同样，它们尚未通过稳定的反向遗传学策略（如基因编辑）进行功能验证。
3.4. 果胶修饰
3.4.1. 果胶酯酶(PE)
果胶的稳态由不同的果胶调节酶控制。其中，果胶酯酶包括果胶乙酰酯酶(PAE)和果胶甲酯酶(PME)。PAE催化细胞壁的去乙酰化和乙酸盐的释放，导致果胶内聚力丧失。PME催化HG的去甲酯化，产生游离羧基并释放质子。PME有两种作用模式：块状模式和随机模式。块状模式下的去甲酯化HG可以与Ca2+交联形成“鸡蛋盒”结构，增强细胞间粘附，使细胞壁变硬。而在随机模式下，PME改变了果胶性质，形成去甲酯化的HG，成为其他果胶调节酶的底物。由于成熟果实通常呈酸性，这可能促使PME以随机模式工作，从而促进软化。
在苹果中，通过VIGS沉默MdPAE10可显著增加果肉硬度。在桃中，Prupe.7G192800在溶质桃果实发育过程中表达升高。在林丛草莓中，瞬时沉默FvPME38/39可延迟果胶降解和软化，而过表达则起相反作用。因此，与果实相关的PME基因有望作为控制果实软化的候选基因。
3.5. 聚半乳糖醛酸酶(PG)
PG是一类催化去酯化聚半乳糖醛酸分解的酶，是果胶降解的最后步骤之一。根据水解活性，PG分为内切-PG、外切-PG和鼠李-PG。其中，内切-PG被广泛认为是果实硬度的主要决定因素。在蔷薇科家族中，内切-PG活性在樱桃、桃和黑莓的果实成熟过程中增加，与软化相关。编码内切-PG的基因已在蔷薇科各物种中被广泛鉴定。苹果PG1反义抑制可增强细胞粘附和果实硬度。樱桃PavPG38、桃PpPG、梨PcPG1/2均被发现与果实质地决定相关。在草莓中，敲低FaPG1或FaPG2可显著增加果实硬度，但联合抑制并未显示出更强的叠加效应。然而，驯化和后续的定向选择可能已经固定了大多数功能性PG等位基因，这给育种项目的应用留下了有限空间。
3.6. 果胶酸裂解酶(PL)
PL是另一类催化去酯化聚半乳糖醛酸分解的酶，导致果胶溶解。与PG的水解降解不同，PL催化β-消除反应，随机切割半乳糖醛酸残基之间的α-1,4键，在果胶寡糖中产生不饱和双键。PL基因是另一组在蔷薇科中广泛鉴定、被认为与果实硬度相关的关键基因。在桃中，沉默PpePL1或PpePL15可延迟果胶解聚并增加采后硬度。在栽培草莓中，敲低FaPL1可产生更硬的成熟果实，且不影响颜色、可溶性固形物或花青素含量。在林丛草莓中，FvePL1、FvePL4和FvePL7的过表达和沉默均证实了它们在软化中的作用。在苹果中，瞬时过表达MdPL5会增加硬度。番茄的CRISPR/Cas双敲除研究表明，PL对果实软化的主导作用超过了PG。相比之下，蔷薇科的证据表明，PL和PG对软化的贡献大致相等。但大多数研究依赖于瞬时过表达或基因沉默，可能存在剂量和脱靶效应，仍需CRISPR/Cas敲除（包括双基因编辑）来严谨评估PL和PG对果实硬度的功能。
3.7. β-半乳糖苷酶(β-Gal)
β-Gal是一种糖基水解酶，可从果胶和半纤维素侧链的非还原末端移除β-D-半乳糖基残基。细胞壁结合半乳糖基残基的减少，与该酶相关，是果实成熟过程中最明显的细胞壁组成变化之一。半乳糖基残基的丢失可能增加细胞壁孔隙度，增强其他酶对细胞壁的降解。在苹果中，β-Gal对采后果实硬度损失的影响比PG和PME更大。苹果Mdβ-GAL2、梨PpGAL1/4、桃PpBGAL16的表达在成熟期升高。VIGS沉默PpBGAL16可增强桃果实硬度。草莓Faβ-Gal4的反义抑制减少了软化，但也减小了果实大小。尽管梨和苹果的β-Gal基因与软化正相关，但这些基因尚未通过基因编辑等反向遗传学研究进行功能分析，其潜在的副作用也未知。
3.8. 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶(RGL)
RGL参与降解RG-I主链。在几种软果（如黑莓、苹果、梨、草莓）中，RGL活性在采收前即可检测到，可能有助于果实软化。在草莓中，已鉴定出17个编码RGL的基因。其中，果实特异性FaRGLyase1受ABA诱导，在成熟期表达升高。RNAi沉默FaRGLyase1可增强成熟果实硬度。但值得注意的是，FaRGLyase1在草莓不同物种中表现出不同的表达谱，表明它可能也参与营养组织的细胞扩张，其功能缺失可能导致多效性副作用。目前，RGL对果实硬度的功能仅在草莓属中得到验证，其他蔷薇科果实仍需验证。
4. 转录因子
果实硬度是一个复杂性状，由多个细胞壁修饰和降解基因共同控制。因此，编辑多个此类基因预计比对单个基因编辑产生更强的硬度效应。然而，在异交和多倍体物种中，同时靶向多个基因在技术上具有挑战性。因此，靶向控制细胞壁酶网络的关键转录因子(TF)可能是一个更实用的策略。
4.1. MADS-box转录因子
MADS-box基因在多种发育过程中发挥基础作用，特别是花器官发育的调控。在蔷薇科中，C类SHP亚组基因与果实发育相关。桃PpPLENA在番茄中异位表达导致果实变软，并上调β-GAL、PME、EXP等软化相关基因。草莓FaSHP的下调可显著抑制FaPG1、FaPL、FaEG1等硬度相关基因。然而，在苹果中，SHP同源基因与果实硬度的关联不显著，这可能反映了Malus基因组中旁系同源基因的功能冗余。
A类FRUITFULL基因和E类SEPALLATA亚组基因也参与果实软化调控。樱桃PaMADS7、中国樱桃CpMADS47、溶质桃PrupeSEP1和草莓FaMADS9的抑制与果实成熟和软化延迟相关。软化延迟主要归因于多种细胞壁基因的下调。进一步研究表明，PG、PME、EXP基因是SEP TFs常见且直接的下游靶标。
4.2. WRKY转录因子
WRKY转录因子在高等植物中广泛存在，在调控胁迫响应和发育过程中起关键作用。它们参与果实成熟，特别是细胞壁降解的作用，仅被部分探索。在林丛草莓中，FvWRKY48通过W-box元件结合FvPLA启动子，从而增强FvPLA表达，导致果胶降解增强和果实软化。在草莓中，FaWRKY29和FaWRKY64的瞬时沉默可显著减少灰霉病感染，这可能是由于几个PME基因表达减少所致。这些变化可能改变果胶重塑和细胞壁降解，从而增强果皮对病原体入侵的抵抗力。因此，WRKY基因可能调控草莓等蔷薇科物种的果皮强度，但仍需稳定的基因验证。
4.3. NAC转录因子
NAC基因，如番茄的NAC-NOR和SlNOR-like1，与果实软化相关。在蔷薇科家族中，草莓、桃和苹果中也鉴定出NAC基因。草莓FaNAC035（番茄NAC-NOR和NOR-like1的同源基因）在果实组织中特异性表达。RNAi沉默FaRIF会导致草莓果实质地更硬。CRISPR敲除林丛草莓FvRIF也能增强果实硬度。分子实验证实，FvRIF蛋白结合FvPL2、FvPG2、FvEXP3的启动子，正向调控其表达。在桃中，PpNAC1（番茄NAC-NOR的同源基因）调控桃果实软化相关基因PpPME1、PpPG1、PpPL1的表达。在苹果中，NAC18.1的遗传变异与苹果果实质地差异相关。另一个NAC，MdNAC1-L，通过激活MdPL5启动子活性来增强成熟和软化。NAC基因在果实硬度中的作用在植物家族间似乎是保守的，因此它们可能是有希望的目标。
4.4. 转录因子与激素调控
转录因子在内源植物激素的下游或并行发挥作用，这些激素调控果实成熟。蔷薇科家族包含跃变型和非跃变型果实。乙烯是跃变型果实成熟的主要调节因子，而ABA是非跃变型果实成熟的核心调节因子。NAC和MADS-box基因似乎是全局成熟调节因子，在不同果实类型中具有保守作用。在跃变型蔷薇科物种（如苹果、桃）中，MdNAC1-L和PpNAC1诱导乙烯生物合成基因表达。在非跃变型物种中，FaRIF和FvRIF调控ABA相关基因的表达。在草莓中，FaSHP似乎位于FaRIF的下游，并受ABA调控。此外，在非跃变型蔷薇科果实中涉及的转录因子，如FvRIF、FvWRKY48、PaMADS7，都对ABA有响应。总之，这些研究表明上述TFs在跃变型和非跃变型果实类型中具有调控果实硬度的保守功能，这使它们成为增加蔷薇科果实硬度的有希望的候选者。
5. 蔷薇科作物的硬度育种
细胞壁降解基因的功能缺失等位基因是隐性的，只有当所有活性等位基因都发生突变时才会表现出强烈表型。对于自交可育的二倍体作物（如桃）的育种者来说，由于此类作物的遗传学和育种相对简单，可以很容易地获得纯合隐性突变体。然而，对于异交和多倍体作物，如苹果和栽培草莓，情况则复杂得多。幸运的是，CRISPR-Cas等精确基因编辑技术为在多倍体、异交作物中有效创造和利用隐性功能缺失等位基因提供了革命性的工具。通过使用多基因编辑或编辑上游主效转录因子，可以更有效地实现对硬度性状的改良。本文综述的知识将有助于设计高效策略，将这些基因应用于旨在提高蔷薇科作物货架期的育种计划中。
