《Postharvest Biology and Technology》：Biocontrol efficacy and mechanisms of
Bacillus proteolyticus L181 against postharvest sour rot of citrus
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柑橘酸腐病生物防治研究中发现枯草芽孢杆菌L181及其挥发性有机物可有效抑制病原菌孢子萌发、菌丝生长和孢子形成，通过转录组学揭示其干扰病原菌代谢通路，诱导宿主抗氧化酶活性增强，体内试验证实其显著降低病害发生率和严重程度，GC-MS鉴定出2-甲基丁酸等关键抑菌VOCs，为开发环保的生物防治策略提供理论依据。
赖伟强|梁宇|李行洲|龙超安
中国华中农业大学国家柑橘种质创新与利用重点实验室、国家柑橘保存技术研发中心、国家柑橘育种中心，武汉430070
摘要
由Geotrichum citri-aurantii真菌引起的柑橘酸腐病是柑橘收获后最具破坏性的病害之一，会导致严重的品质下降和巨大的经济损失。目前对柑橘酸腐病的管理主要依赖化学杀菌剂；然而，由于杀菌剂抗性、残留问题和环境风险，其使用受到越来越严格的限制。本研究评估了蛋白酶解杆菌（Bacillus proteolyticus）L181对Geotrichum citri-aurantii的生物防治潜力。L181菌株及其挥发性有机化合物（VOCs）在体外显著抑制了孢子萌发、菌丝生长和孢子形成。显微镜观察显示，VOCs导致菌丝变形，包括断裂、收缩和细胞质颗粒化。转录组分析表明，VOCs暴露下调了Geotrichum citri-aurantii的关键代谢途径，包括MAPK信号传导、氮代谢、糖酵解和丙酮酸代谢。酶活性测定表明，L181菌株通过诱导过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化苯甲酰酶（PAL）增强了柑橘的抗性。体内实验验证了其在降低病害发生率和严重程度方面的有效性。此外，L181还对多种收获后病原体表现出广泛的抗真菌作用。GC-MS分析鉴定出10种挥发性物质，其中2-甲基丁酸和3-甲基丁酸具有强抗真菌活性。这些发现突显了L181菌株作为柑橘酸腐病生物防治剂的潜力。
引言
柑橘果实因其独特的风味和高营养价值而在全球广泛种植，是消费者最喜爱的水果之一（Zheng等人，2025年）。在中国，超过90%的柑橘以新鲜形式消费，年产量超过6000万吨，约占全球柑橘产量的60%（Li等人，2025年）。然而，柑橘果实极易在收获、储存、运输和销售过程中受到病原微生物的侵害，导致严重的经济损失（Li等人，2025年）。因此，减轻收获后病原体侵染并延长柑橘的储存期和保质期已成为研究和产业界关注的重点领域（OuYang等人，2022年）。
在各种柑橘收获后病害中，由Geotrichum citri-aurantii引起的酸腐病长期以来被认为是全球范围内最普遍和最具破坏性的病害之一（Wang等人，2022年）。这种病原体在柑橘生产区广泛分布，是导致柑橘酸腐病的主要原因，会导致组织迅速软化和严重的收获后损失（Klein和Kupper，2018年；Zhao等人，2025年）。目前广泛使用的化学杀菌剂如噻苯达唑、嘧菌酯和咪唑菌胺对酸腐病的防治效果有限（Ai等人，2025年）。此外，这些杀菌剂的滥用和残留问题引发了对人类健康和环境安全的严重担忧（OuYang等人，2022年）。虽然热水处理和UV-C辐射等物理方法有效，但通常需要专用设备，并可能损害柑橘的感官和理化品质，从而限制了其实际应用（Zhou等人，2024年）。因此，开发安全、可持续的柑橘酸腐病控制策略至关重要，这些策略应符合环境和人类健康的要求。
近年来，利用微生物拮抗作用来控制收获后果实病害已成为一种可持续策略（Zhou等人，2024年）。在各种化学杀菌剂的替代方案中，生物防治因其环保和安全性而具有最大的潜力（Zhang等人，2025年）。在多种生物防治剂中，蛋白酶解杆菌属（Bacillus spp.）因其强大的环境适应性、形成抗逆内孢子的能力以及产生多种代谢产物的能力而受到广泛关注（Etesami等人，2023年）。蛋白酶解杆菌属是一种革兰氏阳性细菌，具有生物防治和促进植物生长的双重特性（Prasad等人，2023年）。该菌属具有快速繁殖、广泛分布以及对人类和环境的低风险，使其成为管理水果和蔬菜病害的宝贵微生物资源（Lastochkina等人，2019年）。蛋白酶解杆菌属的一个显著特点是其多样的次级代谢能力，其基因组约有5-8%编码次级代谢产物的生成途径，能够产生多种拮抗化合物。其生物防治机制包括直接抑制植物病原体、诱导系统抗性（ISR）以及与病原体竞争生态位。多种蛋白酶解杆菌菌株在控制由真菌和细菌引起的植物病害方面表现出显著效果。例如，Bacillus velezensis BV07及其代谢产物显著抑制了Penicillium digitatum的菌丝生长（Zhu等人，2025年）。此外，Bacillus subtilis PM57和Bacillus cereus PM38显著减少了由Erwinia carotovora pv.引起的玉米细菌性茎腐病（Ullah等人，2025年）。最近，一些新的蛋白酶解杆菌菌株显示出良好的生物防治潜力。例如，Bacillus proteolyticus OSUB18在拟南芥中诱导了对假单胞菌（Pseudomonas syringae）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的系统抗性（Yang等人，2023年）。此外，Bacillus proteolyticus MITWPUB1通过产生表面活性剂（BSs）抑制了由Sclerotium rolfsii引起的茎腐病（Mukadam等人，2024年）。然而，蛋白酶解杆菌对柑橘酸腐病的生物防治潜力及其机制仍不明确，缺乏系统的研究。因此，需要进一步的研究来阐明蛋白酶解杆菌在管理柑橘收获后病害方面的潜力。
本研究分离出一种拮抗性细菌菌株L181，并初步鉴定为蛋白酶解杆菌。该菌株在体外对多种病原真菌表现出强烈的抗真菌活性，包括导致柑橘酸腐病的Geotrichum citri-aurantii，并能产生具有抗真菌特性的生物活性VOCs。因此，本研究旨在：（1）确定L181菌株在体外和体内抑制柑橘酸腐病的能力；（2）利用转录组方法分析L181衍生的VOCs熏蒸后Geotrichum citri-aurantii的全球转录反应；（3）评估L181菌株触发宿主防御反应的潜力；（4）鉴定负责观察到的活性的关键抗真菌VOCs。这些发现不仅扩展了具有生物防治潜力的蛋白酶解杆菌菌株的多样性，还为开发环保的柑橘收获后病害管理策略提供了理论和技术基础。
部分摘录
病原体和培养条件
本研究中使用的病原真菌包括Geotrichum citri-aurantii（AY-1）、Penicillium digitatum（P44, N1）、Penicillium italicum（P6）、Penicillium chrysogenum（Q, H）、Penicillium expansum（PTY-1, PTY-2）、Penicillium ulaiense（Pu）、Rhizopus stolonifer（MG）和Aspergillus niger（HQ）。所有真菌菌株均保存在华中农业大学的菌种库中。菌株在25°C下于PDA培养基上预培养3-4天后进行后续实验。
筛选抑制Geotrichum citri-aurantii的蛋白酶解杆菌菌株
实验室保存的蛋白酶解杆菌菌株在28°C下的LB培养基中培养
L181菌株的CB对Geotrichum citri-aurantii表现出显著的抑制作用
共筛选了27株蛋白酶解杆菌菌株，其中6株对Geotrichum citri-aurantii表现出显著的抑制作用（图1A）。在这6株菌株中，YB2和YB55产生的抑制晕圈相对较大（表1）。因此进行了二次筛选。在二次筛选过程中，虽然YB2和YB55之间的抑制晕圈大小没有显著差异，但YB2的透明区比YB55更大。因此，选择YB2菌株进行进一步研究
讨论
由Geotrichum citri-aurantii引起的酸腐病是柑橘果实收获后最具破坏性的病害之一（Xu等人，2022年）。尽管化学杀菌剂仍是主要的控制方法，但对食品安全和环境可持续性的日益关注凸显了生物防治替代方案的需求。然而，控制柑橘酸腐病特别具有挑战性，因为没有一种杀菌剂对Geotrichum citri-aurantii具有高度特异性，且其感染过程迅速且适应性强
结论
本研究表明，蛋白酶解杆菌L181是防治由Geotrichum citri-aurantii引起的柑橘酸腐病的有前景的生物防治剂。L181菌株及其VOCs在体外有效抑制了病原体的孢子萌发、菌丝生长和孢子形成。VOCs还导致真菌菌丝出现严重的形态和超微结构损伤。转录组分析表明，VOCs扰乱了与生长和毒力相关的多个代谢途径，而酶活性测定
作者贡献声明
龙超安：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取。李行洲：实验研究、数据管理。梁宇：实验研究、数据管理。赖伟强：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32472407）、华中农业大学-AGIS合作基金（项目编号：SZYJY2023001）以及中国农业部（MOF）和农业农村部（MARA）中国农业研究系统的财政支持。
