一种用于红藻多糖糖化及微生物从头合成胆红素的顺序式模块化平台

《Process Biochemistry》：A Sequential and Modular Platform for Red Algal Polysaccharide Saccharification and De Novo Microbial Bilirubin Biosynthesis

本研究开发了一种整合的序列糖解和发酵生物工艺，从红藻多糖中生物合成胆红素（BR）。通过优化酶 cocktail 分解混合多糖，有效释放D-半乳糖。代谢工程改造Corynebacterium glutamicum，调控天冬氨酸途径和戊糖磷酸途径，平衡糖解与BR合成通量，实现1升批次发酵中23.97 mg/L BR产量，产率0.60 mg/g。验证了合成BR的抗氧化活性，为可持续生物制造提供平台。

　　

Joonhee Chang|Xiaoyu Shi|Minhye Kim|Myeong-Eun Lee|Jun Won Oh|Sung Ok Han

韩国大学生物技术系，首尔02841，大韩民国

摘要

海洋生物质是一种有前景的可再生原料，可用于可持续生产高价值的生物活性化合物。在这项研究中，开发了一种集成式的连续糖化与发酵生物工艺，以从红藻多糖中生物合成胆红素（BR）。为了最大化红藻的利用价值，采用了一种优化的酶组合，该组合能够高效释放D-半乳糖作为主要的可发酵碳源。为了提高BR的产量，通过途径水平流量控制对Corynebacterium glutamicum进行了代谢工程改造。为了增加前体胆绿素（BV）的可用性，减弱了天冬氨酸途径中的代谢竞争，同时通过戊糖磷酸途径增强了NADPH的再生。关键在于实现了途径平衡，使半乳糖的吸收与BR的生物合成流程同步。最终经过改造的菌株在1升批次发酵中使用半乳糖生产了23.97毫克/升的BR，产率为0.60毫克/克BR/半乳糖。通过抗氧化活性测试的功能验证证实，微生物合成的BR具有与商业标准相当的自由基清除能力。这种连续糖化发酵策略展示了通过战略性代谢调节将低成本海洋来源的多糖转化为高价值生物制剂的可行性，为可持续生物制造提供了一个稳健且经济可行的平台。

引言

气候变化、环境退化和化石燃料枯竭带来的日益严峻挑战正在推动全球向通过环保工业生物技术实现高价值生化产品的可持续生产方向发展[1]。传统制造方式因环境法规、伦理问题以及有限资源而面临越来越多的限制，这凸显了基于可再生生物质开发稳健生物工艺的必要性[2]。在可再生原料中，海洋生物质因其快速生长、高光合作用效率以及对土地和淡水资源与粮食作物的竞争较小而具有吸引力[3]。特别是，红藻富含基于半乳糖的硫酸化多糖，如琼脂和κ-卡拉胶，这些多糖无需苛刻预处理即可通过酶法糖化为D-半乳糖[4]。然而，大多数先前的研究主要集中在单独水解琼脂或κ-卡拉胶上，往往忽略了从混合多糖生物质中协同回收总碳水化合物的可能性。尽管已经使用了诸如κ-卡拉胶酶CgkA或β-琼脂酶和α-新琼脂糖水解酶的组合，但实现完全糖化仍然是一个挑战[5]、[6]。这种生化复杂性构成了一个重大瓶颈，因为混合红藻中的顽固结构连接需要多目标酶法处理才能实现完全液化。在这项研究中，开发了一种由五种酶组成的协同酶系统：AgaA、AgaB、AhgA、CgkA和IdsA3，专门用于克服混合琼脂和κ-卡拉胶的结构异质性。这种有序的酶法处理方法解决了海洋生物质的生化复杂性问题，为后续的微生物转化提供了稳健的上游工艺。

源自红藻的半乳糖已成为一种有前景的微生物原料，但其用于生产高价值药物（如胆红素BR）的应用仍尚未得到充分探索[7]、[8]、[9]。长期以来，胆红素被认为是一种有毒废物，因为其在高浓度下具有神经毒性[10]。然而，最近的研究表明，胆红素是一种强效的抗氧化剂和抗炎剂，对心血管和神经退行性疾病具有显著的治疗潜力[4]、[11]、[12]、[13]。尽管具有潜力，但目前胆红素的供应主要依赖于动物胆汁的提取，但这受到产量低、成本高、污染风险以及伦理问题的限制。纯化胆红素的高市场价格加上动物来源供应链的不稳定性，凸显了迫切需要一种可持续的、基于生物的替代方案[14]。虽然已经证明了胆红素的化学合成方法，但需要多个复杂步骤且整体产率较低，因此在大规模应用上不切实际[15]。因此，迫切需要可持续且可扩展的生物技术方法来解决这一限制。

微生物生物合成胆红素代表了一种有前景的环保解决方案，结合了发酵的可扩展性和过程控制。虽然合成生物学的进步使得在工程宿主中生产胆红素成为可能，但许多现有策略仍然严重依赖精炼的碳源和昂贵的前体外源补充。在大肠杆菌中通过工程化血红素降解实现了胆红素的生物合成，在Streptomyces atratus（一种天然产生的红霉素生产菌）中，胆绿素和胆红素被证明是次要代谢产物，这表明放线菌具有替代的生物合成能力[9]、[16]。尽管这些研究证实了微生物合成胆红素的潜力，但它们主要依赖葡萄糖作为碳源，引发了关于食物竞争和成本的担忧[17]。此外，像大肠杆菌这样的革兰氏阴性宿主的内毒素谱和监管限制使其不太适合药物应用。还有一些研究使用微生物宿主菌株作为全细胞催化剂，通过生物转化将外源提供的前体（如血红素或胆绿素）转化为胆红素[18]、[19]。尽管这些方法展示了高转化效率，但它们依赖于昂贵的前体补充，并不构成真正的从糖类“从头”合成胆红素的过程（表1）。

作为工业微生物底盘，Corynebacterium glutamicum在卟啉衍生分子的生物合成方面具有独特优势。作为一种公认安全（GRAS）的微生物，它已经证明是大规模生产氨基酸、化学品和生物燃料的可靠平台。重要的是，C. glutamicum在C5途径上的代谢通量异常高，这是卟啉和血红素生物合成的关键代谢途径[7]、[20]、[21]、[22]。虽然胆红素的产生常常受到卟啉中间体的细胞毒性和高NADHP需求的限制，但C. glutamicum通过其内在活跃的PP途径表现出对氧化应激的强大耐受性，提供了优越的氧化还原环境。这种生理韧性对于稳定像胆红素这样的光敏和氧化还原活性分子至关重要。此外，它不产生内毒素，并且具有利用多种底物的代谢灵活性，使其成为可持续胆红素合成的强大平台[23]。另外，C. glutamicum避免了与革兰氏阴性宿主相关的限制和安全风险，从而增加了其工业应用的可能性。

本研究提出了一个集成平台，包括两个优化模块：红藻的先进酶法糖化和在C. glutamicum中从半乳糖“从头”合成胆红素（图1）。通过分别优化这些阶段，建立了一个功能性的海洋生物精炼原型。定制的酶组合高效水解了红藻多糖（包括琼脂和卡拉胶），增加了可用的半乳糖量。将合成的半乳糖吸收途径引入C. glutamicum，使其能够有效吸收半乳糖。策略性地过表达了胆红素生物合成基因，同时下调了竞争途径以增强向胆红素的转化流量。优化了生成NADPH的途径以提高NADPH水平。据我们所知，这是首次使用GRAS宿主从半乳糖合成胆红素的报道。除了生产之外，合成的胆红素还表现出显著的抗氧化活性，证明了其作为生物活性分子的潜力。通过将上游糖化与下游生物合成相结合，这种方法提供了一种可扩展的、可持续的高价值生化产品生产路线。这项工作确立了红藻作为下一代微生物生产功能性生物活性分子的有希望的原料。

章节片段

菌株、质粒构建和遗传操作

本研究使用的所有基因、质粒、细菌菌株和引物详见补充材料。C. glutamicum ATCC14067被用作亲本菌株，并经过连续工程改造，以增强四吡咯前体的供应，减弱竞争性副产物途径，并增强细胞内NADPH的再生。前体途径的优化包括加强血红素和C5途径，同时减弱天冬氨酸生物合成途径以重新定向

用于可持续碳源供应的红藻生物质的酶法糖化

为了高效和可持续地利用红藻生物质作为碳源，开发了一种针对性的酶法糖化策略，使用了多种具有碳水化合物活性的酶。根据底物特异性和协同作用选择了五种关键酶：Zobellia galactanivorans中的AgaA和AgaB用于琼脂糖降解，Pseudoalteromonas carrageenovora中的CgkA以及Z. galactanivorans中的IdsA3用于卡拉胶处理（图2a）。AgaA和

结论

本研究利用经过代谢工程改造的C. glutamicum，建立了从半乳糖（红藻的主要成分）生产胆红素的微生物平台。通过引入半乳糖利用途径、增强前体途径、优化辅因子以及重新定向流量，最终菌株G2_BR_AP_H36P_tac实现了“从头”合成胆红素。在这项工作中，精制的半乳糖被策略性地用作发酵过程中的标准化模型底物，以严格验证

资助

本研究得到了韩国海洋科学技术院（KIMST）的支持，该机构由海洋渔业部资助（RS-2022-KS221595），以及由贸易、工业与能源部（MOTIE, Korea）资助的技术创新计划（RS-2024 00435006）和韩国大学的资助。

CRediT作者贡献声明

Joonhee Chang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。Minhye Kim：方法学。Xiaoyu Shi：概念化。Jun Won Oh：调查。Myeong-Eun Lee：验证。Sung Ok Han：监督，项目管理，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。