基于工程改造的噬菌体尾刺蛋白的磁分离技术（T-MS），用于快速分离和选择性检测存活的沙门氏菌

《Talanta》：Engineered phage tail spike protein-based magnetic separation (T-MS) for rapid isolation and selective detection of viable Salmonella

本研究通过工程改造Salmonella噬菌体SFP10的尾峰蛋白2（gp162），去除头部结合域并引入二氧化硅结合基团，构建了高效特异性磁分离探针T-MS。结合ATP生物发光法，该技术可在30分钟内检测冰 lettuce中的活菌（检测限41 CFU/mL），并在牛奶、生菜、猪肉等基质中保持95.19%-107.23%的高回收率，为食品中活菌检测提供了快速可靠的新方法。

　　

崔大熙|安智勋|李娜媛|朴海俊|孔敏淑

韩国首尔科技大学食品与生物技术研究所食品科学与生物技术系，01811，大韩民国

摘要

沙门氏菌是全球食物中毒的常见原因，因此需要开发特定的快速检测工具。为了解决这个问题，我们改造了来自沙门氏菌噬菌体SFP10的尾刺蛋白2（gp162）。一种缺乏N端头部结构域的催化失活突变体（Mut）与野生型相比，表现出更强的结合能力。将Mut与硅结合域融合，使其能够固定在硅涂层磁珠上，从而实现基于TSP的磁分离（T-MS）。T-MS在缓冲液中特异性地捕获了80-90%的沙门氏菌 Typhimurium细胞，并在各种食品基质（牛奶、生菜和猪肉）中保持了捕获效率。T-MS–ATP生物发光检测方法在生菜中的检测限为41 CFU/mL。此外，该方法在猪肉、鸡胸肉、生菜和牛奶中产生了可靠的发光信号，30分钟内可回收95.19%至107.23%的活沙门氏菌细胞。总体而言，T-MS结合ATP生物发光检测方法提供了一种快速、特异性强且高度可靠的活沙门氏菌细胞检测方法。

引言

由沙门氏菌引起的沙门氏菌病是美国微生物食物中毒导致住院和死亡的主要原因之一[1]。美国疾病控制与预防中心（CDC）估计，沙门氏菌每年导致约130万例食物中毒、12,500例住院和238例死亡[2]。由于其高发率，沙门氏菌病每年造成的损失估计约为40亿美元[3]。此外，沙门氏菌是一种危险的动物源性病原体，家养动物如狗、猫、家禽甚至爬行动物都可能是沙门氏菌的携带者[4]。虽然食物是沙门氏菌的主要来源，但在某些情况下也可以通过与动物的直接或间接接触传播[5]。因此，对于能够预先检测沙门氏菌的特定和精确检测方法的需求不断增长。

包括国际标准化组织（ISO）、官方分析化学家协会（AOAC）、美国食品药品监督管理局（FDA）和美国农业部食品安全检验服务局（FSIS）在内的多个监管机构仍然采用基于培养的检测方法作为沙门氏菌检测的参考标准[6]。传统的沙门氏菌检测方法（如ISO 6579-1:2017）通常包括四个基本步骤：非选择性富集、选择性富集、在选择性琼脂培养基上的筛选以及通过生化和血清学测试进行确认[6]。这些方法对目标微生物显示出可靠的高特异性和敏感性，但存在不可培养的活细菌（VBNC），可能导致总活细胞数量被低估[7]。此外，这些方法至少需要三天时间才能将活细胞培养到可检测的水平，因此需要进一步改进以实现快速和经济的沙门氏菌检测。目前，免疫磁分离（IMS）作为一种有前景的解决方案，可以减少富集时间并选择性浓缩样本中的目标微生物。IMS是一种免疫学技术，涉及将生物分子（如抗体或蛋白质）与顺磁珠（MBs）结合[8]。当这些固定的MBs加入异质样本中时，它们可以区分样本基质中的非目标细菌和目标细菌，形成目标结合探针-MB复合物。通过施加磁场，可以轻松将结合在MBs上的细菌从背景基质中分离出来。IMS方法使用简单的磁铁，不需要昂贵或复杂的设备，因此既节省时间又经济。

尽管有这些优点，IMS的性能在很大程度上依赖于亲和分子的识别能力。抗体仍然是各种领域中检测微生物病原体、病毒和毒素的主要捕获剂[9]。然而，由于依赖哺乳动物细胞系统，抗体的生产成本较高，并且经常存在重复性问题[10,11]。大多数用于食品中沙门氏菌检测的免疫学方法基于识别细菌细胞表面脂多糖（LPS）或鞭毛上的O抗原的抗体。然而，沙门氏菌与其他肠杆菌科（如大肠杆菌和柠檬酸杆菌）具有某些抗原共性，这可能导致交叉反应[12,13]。

最近，人们还探索了其他识别元件，如适配体、凝集素和抗菌肽，以克服抗体的局限性[[14], [15], [16], [17], [18]]。适配体是单链核酸，通过序列依赖性折叠识别目标，相比抗体具有优势，包括无需动物参与的体外选择、高批次间重复性和易于化学修饰[[19], [20]]。然而，它们的结合性能容易受到环境条件的影响，在复杂基质中保持结构完整性具有挑战性[21,22]。凝集素是结合微生物细胞表面糖胺聚糖结构的碳水化合物结合蛋白。它们相对较低的成本和对多糖的天然亲和力使其适合捕获病原体；然而，广泛的糖胺聚糖识别特性可能导致菌株水平的特异性受限[23,24]。抗菌肽主要通过静电吸引和与细胞膜的疏水相互作用与细菌细胞相互作用，而不是通过特异性识别表面分子，从而实现快速和广谱结合[25]。虽然它们的小尺寸和合成便利性具有优势，但其膜驱动的结合机制可能导致分析条件下的基质依赖性和菌株水平特异性受限[26,27]。因此，迫切需要稳健且可工程化的检测配体，以有效识别复杂样本中的沙门氏菌。

噬菌体是一种感染并在细菌宿主细胞内复制的病毒[28]。作为最丰富的生物实体，噬菌体具有高度独特的宿主靶向能力，因此在食品安全、农业和生物技术等多个领域得到广泛应用[[29], [30], [31], [32]]。噬菌体的显著特异性归因于其受体结合蛋白（RBPs），这些蛋白通常位于噬菌体尾部，作为尾刺蛋白（TSPs）或尾纤维蛋白（TFPs），它们通过识别特定的配体（如细菌表面的多糖或蛋白质）来决定噬菌体的宿主范围[33]。RBPs是设计用于选择性靶向宿主细胞、穿透细胞膜并将噬菌体基因组注入宿主细胞质的结构机制[34]。除了整个噬菌体外，RBPs还因其优势特性而成为诊断应用中的有吸引力的识别元件。首先，RBPs表现出高宿主特异性，减少了系统发育相关物种之间的交叉反应，并能够区分血清型[[35], [36], [37]]。这种特异性源于它们精确识别并结合宿主细菌表面相应目标分子的生物学功能，从而启动感染周期。其次，噬菌体RBPs在各种环境条件下（包括热、蛋白酶暴露和pH变化）表现出高稳定性，这对实际诊断应用非常有利[36,38,39]。最后，预计噬菌体RBP的生产将具有成本效益，因为RBPs可以在大肠杆菌中重组生产，而抗体的生产通常依赖于哺乳动物细胞表达系统。最近，已有几种方法将噬菌体RBPs整合到生物传感器平台中，用于检测各种病原体[36,40,41]。

在这项研究中，我们通过失活SFP10噬菌体的LPS降解能力和去除非必需的头部结合域，改造了沙门氏菌特异性尾刺蛋白2（gp162）。我们确认了这种改造后的TSP2作为捕获剂对沙门氏菌的增强结合能力和特异性。为了将这种改造后的TSP2固定在硅涂层磁珠上，我们引入了来自蜡样芽孢杆菌 CotB1蛋白的硅结合部分（SiBD）。基于这种改造后的TSP2的磁分离（T-MS）在缓冲液和食品基质中对沙门氏菌肠炎亚种表现出高特异性和回收率。此外，T-MS结合ATP生物发光检测方法能够在30分钟内检测到猪肉、鸡胸肉、生菜和牛奶样本中的活沙门氏菌细胞。基于这些结果，我们认为这种检测方法在食品安全和诊断应用中提供了高可靠性和时间效率。

部分摘录

细菌菌株和培养条件

本研究中使用的细菌菌株列于表1中。所有革兰氏阴性菌株均在37°C下，在Luria-Bertani（LB）肉汤中振荡培养。枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌细胞在37°C下，有氧条件下在Tryptic Soy Broth（TSB）中培养。琼脂培养基是通过向肉汤培养基中添加1.5%的琼脂制备的。

重组蛋白的克隆、表达和纯化

删除了N端头部结合结构域的野生型尾刺蛋白基因（SFP10 gp162ΔN，称为TSP2），通过聚合酶链反应从SFP10溶菌体中扩增

生成对沙门氏菌菌株具有增强结合能力的改造SFP10 TSP2及其结合特性

噬菌体TSPs通常以其酶活性而闻名，这些酶可以降解宿主细菌的细胞外结构，如荚膜多糖（CPS）、胞外多糖（EPS）和脂多糖（LPS）[50]。这种酶活性促进了TSPs与其宿主细胞的可逆结合，随后将噬菌体DNA注入宿主[34]。Baxa等人的先前研究[51]报告称，替换沙门氏菌噬菌体P22 TSPs的三个羧基残基中的任何一个

结论

为了满足对快速、特异性和可靠检测活沙门氏菌的全球需求，我们开发的T-MS和ATP生物发光检测方法在生菜中的检测限为41 CFU/mL，仅需30分钟。该方法在猪肉、鸡胸肉、生菜和牛奶中捕获的沙门氏菌的回收率也较高（95.19%–107.23%），支持磁捕获后的可靠定量。由于尾刺蛋白来源于噬菌体，而这些噬菌体是最

CRediT作者贡献声明

崔大熙：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。安智勋：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。李娜媛：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。朴海俊：撰写——原始草稿、研究。孔敏淑：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府（MSIT）资助，项目编号：RS-2023-00249925）和韩国食品药品安全部（项目编号：RS-2024-00332071）的资助。