《Talanta》：Endogenous enzyme-driven unarming of spherical nucleic acid in a divide-and-conquer pattern for amplified imaging of microRNA in tumor cells
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精准识别肿瘤细胞对早期诊断、预后评估和术后复发风险评价具有重要意义，但低丰度miRNA标记物的细胞内成像面临挑战。本研究开发了一种基于DNA纳米机器的AHP-AuNP探针，利用内源性酶APE1驱动ERDN信号放大机制，实现miRNA-21的高灵敏度检测（低至27.1 pM），无需转染剂即可主动进入肿瘤细胞，通过荧光信号区分癌细胞与正常细胞，为癌症早期诊断和精准治疗提供工具。
作者：赵龙、黄洪、于新如、毛凯莉、杨宇曦、杨雄、徐立坚、吴在生
中国湖南省湘潭大学生物科学与医学工程学院生物医学纳米材料与器件重点实验室，湖南株洲，412007
摘要
虽然精确识别癌细胞对早期诊断、预测患者预后以及评估手术后复发风险具有重要意义，但对低丰度miRNA生物标志物的细胞内成像仍然极具挑战性，这主要是由于“一对一”信号转导机制的局限性和传感探针（尤其是多组分探针）在复杂生物环境中的脆弱性。本文介绍了一种基于AHP-AuNP纳米探针的方法，该探针能够敏感地放大并成像细胞内的miRNA-21生物标志物。这种探针由金纳米颗粒（AuNP）和一层DNA AHPs组成，DNA AHPs能够识别含有AP位点的目标miRNA-21，而AP位点可以被内切酶APE1切割。与癌症相关的miRNA-21可以特异性地打开AHP-AuNP纳米探针的环茎结构，从而触发ERDN扩增反应。在此过程中，内源性酶（E）、目标miRNA（R）、含有可切割AP位点的DNA探针（D）和金纳米颗粒底物（N）被整合到一个检测系统中，最终导致SNA的解构并产生敏感的荧光信号。即使只有一条DNA链参与信号传导过程，也能检测到低至27.1 pM的miRNA-21，检测限提高了90倍。此外，该方法不受外源酶和miRNA家族成员的干扰，甚至能够轻松检测到单碱基错配。而且，AHP-AuNP纳米探针无需转染剂即可进入活细胞，实现对细胞内miRNA-21的敏感荧光成像，从而能够区分癌细胞和健康细胞。预计AHP-AuNP纳米探针将成为一种强大的诊断工具，用于特异性筛查患者体内的肿瘤细胞，在癌症的早期诊断、手术后的复发预测以及转移评估方面具有巨大潜力。
引言
癌症的发生不仅直接导致患者死亡，还会对患者造成严重的身体和心理创伤，对人类生命和健康构成严重威胁[1]。特异性识别癌细胞对于早期诊断至关重要，并为评估癌症的进展和预后提供了宝贵信息[2]。肿瘤的不同阶段决定了治疗的难度，因此早期诊断对于降低患者死亡率非常重要[3][4][5]。通过设计一个简单的分子检测平台，可以在活细胞中成像相关生物标志物，从而实现单细胞水平上的癌细胞定位，无需复杂的样本处理过程，从而在形态异常之前揭示病理生理信息，便于早期诊断和精准治疗[6][7][8]。近年来，可用于细胞内成像的生物标志物（包括蛋白质[9]、端粒酶[10]、小分子[11]、金属离子[12]和微小RNA（miRNAs）[13][14][15]）引起了广泛的研究兴趣，在精准生物医学诊断方面具有巨大潜力。
miRNAs是由内源基因编码的非蛋白质编码单链RNA分子，长度约为18-25个核苷酸。它们通过调节特定目标信使RNA（mRNAs）的活性，在基因调控中发挥重要作用，并参与多种生理和病理过程[16][17][18]。近年来，大量证据表明miRNAs与多种人类癌症相关，因此成为潜在的生物标志物[19][20][21][22]。例如，miRNA-21的异常表达与多种恶性肿瘤（如慢性淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌和宫颈癌）的增殖、侵袭、迁移和凋亡密切相关[23][24][25]。因此，对异常miRNA表达的敏感检测和细胞内成像对于癌症的早期诊断、预后评估和治疗反应评估至关重要。然而，miRNAs的低丰度、高同源性以及短序列给其表达分析带来了巨大挑战，尤其是在活细胞中的精确成像方面[26,27]。为了提高miRNA成像检测平台的性能，引入了多种信号放大策略来增强荧光生物传感器的检测灵敏度[28]，包括PCR（聚合酶链反应）[29,30]、RCA（滚环扩增）[31][32][33][34][35]、链置换扩增（SDA）[36][37][38]、催化发夹自组装（CHA）[39][40][41]和杂交链反应（HCR）[42,43]。然而，由于生物功能组分的固有脆弱性，信号放大系统在复杂的细胞内环境中难以表现出理想的检测能力。基于DNA的纳米机器作为重要的信号转导器和放大器，在活细胞中的miRNA成像中受到了广泛关注[44][45][46][47][48]，因为它们能够实现“一对多”的信号放大，响应速度快，信号转导效率高，技术简单，特别适用于生物环境[49][50][51]。同时，一些催化生物反应的关键酶在病变细胞（包括癌细胞）中含量丰富，具有高效切割底物的能力[52]。因此，基于酶激活的检测探针常被用于复杂介质中的miRNA检测[53,54]。不幸的是，多组分探针往往因在恶劣的肿瘤内环境中的结构分解而失活。结合含有最少DNA寡核苷酸的DNA纳米机器和催化酶，有望通过敏感成像细胞内miRNAs来准确区分癌细胞。
受到上述催化酶、DNA纳米机器和miRNAs独特性质的启发，我们提出了一种基于内源性酶（E）驱动的目标miRNA回收（R）信号放大方法，该方法利用含有酶切位点的DNA探针（D）和功能化的金纳米颗粒（N）（称为ERDN扩增）在活细胞中敏感成像miRNAs。选择人类apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）作为内源性驱动力，该酶主要存在于不同肿瘤细胞的细胞质中，在碱基切除修复中起关键作用[55][56][57]。APE1主要作用于双链DNA中的AP位点[58,59]；最新研究表明，它也能在DNA/RNA杂交链的AP位点进行切割，尽管效率较低[60][61][62][63]。由于APE1在多种肿瘤细胞中的表达量通常高于正常细胞[64][65][66]，并且能够通过去除AP位点来修复DNA损伤[54,67]，因此设计了一种荧光修饰的DNA发夹探针（称为AHP），该探针含有AP位点，用于特异性识别与癌症相关的miRNA-21。这种探针被固定在金纳米颗粒（AuNP）表面，其荧光通过荧光共振能量转移（FRET）被AuNP淬灭[68,69]，从而形成内源性APE1驱动的AHP-AuNP纳米探针（球形核酸，SNA）。由于核酸修饰的球形物体能够被多种哺乳动物细胞主动内化[70][71][72][73][74][75]，AHP-AuNP纳米探针无需任何转染剂即可进入肿瘤细胞，并通过直接利用内源性APE1对细胞内miRNA产生敏感的荧光响应，从而实现肿瘤细胞的特异性荧光成像。酶促反应和目标miRNA-21的回收导致SNA的内源性解构。相比之下，正常细胞中缺乏miRNA-21和APE1，SNA保持结构完整，健康细胞不会产生可检测的荧光信号，从而区分癌细胞和正常细胞，实现癌症的早期诊断。由于其简单的设计（仅涉及DNA探针）、结构稳定性、高灵敏度和增强的特异性，所设计的AHP-AuNP纳米探针有望成为评估和监测患者肿瘤演变的有效工具，促进癌症管理和精准医学的发展。
试剂和材料
所有寡核苷酸均由上海Sangon Biotech有限公司自行设计和合成。寡核苷酸的序列列于表S1中。人类apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）、尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）和HpaII限制性内切酶（HpaII）购自北京New England Biolabs有限公司。T4 DNA连接酶（T4）和phi29 DNA聚合酶（Phi29）购自苏州Novoprotein有限公司。Tris-(2-carboxyethyl) phosphine（TCEP）和TE……
AHP-AuNP纳米探针的设计及APE1驱动的细胞内miRNA-21成像信号放大机制
图1展示了AHP-AuNP纳米探针（球形核酸，SNA）的设计及其相应的分子机制，该机制通过APE1驱动的ERDN信号放大，有助于区分肿瘤细胞和健康细胞。基于大量关于肿瘤发生与miRNA-21异常表达之间关系的文献报道（包括碱基突变[14,15,44,52][80][81][82][83][84][85]），我们设计了……
结论
总之，我们开发了一种基于内源性APE1酶作为信号放大驱动力的AHP-AuNP纳米探针（本质上是SNA探针），用于活细胞中的miRNA成像。显然，信号转导过程是通过细胞内目标miRNA和内源性酶的协同作用，使球形核酸探针以“分而治之”的方式解构，从而实现荧光信号放大。由于APE1……
作者贡献声明
赵龙：撰写——原始草稿，数据整理，概念构思。
黄洪：数据整理，概念构思。
于新如：数据整理。
毛凯莉：数据整理。
杨宇曦：数据整理。
杨雄：数据整理。
徐立坚：资金获取。
吴在生：撰写——审稿与编辑，研究调查，资金获取，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：52374387）和中国国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：22174020）的支持。我们感谢温州医科大学科研中心的优秀咨询和仪器支持。
