《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering of plant-derived P450scc for
de novo biosynthesis of pregnenolone
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本文针对传统依赖哺乳动物CYP11A1的孕烯醇酮(Prn)生物合成途径存在效率低、系统兼容性差的问题，聚焦植物源P450scc酶催化机制不明、在异源微生物中转化效率低的瓶颈，结合计算结构生物学与酶通道工程，揭示了毛地黄DlCYP87A的催化中间体，并通过底物通道与催化口袋的理性设计，在酿酒酵母中构建了高效合成系统，最终在5-L发酵罐中使工程菌株P4的孕烯醇酮产量达到1.46 g/L。该研究首次实现了植物源P450scc途径的克级孕烯醇酮合成，为规模化生产甾体药物前体奠定了关键技术基础。
甾体激素（如雌激素、雄激素）是调控生殖、发育和全身生理功能的核心调节因子，也是内分泌、肿瘤和激素替代疗法等领域的重要治疗药物。所有下游甾体产物的通用前体是孕烯醇酮（Prn, pregnenolone），其合成关键步骤是甾醇侧链的裂解，这一过程普遍被认为是甾体激素生物合成的限速步骤。然而，传统的生产方法主要依赖动物来源的P450scc（CYP11A1）系统，其复杂的线粒体定位信号、对特定电子传递伙伴（如ADR和ADX）的依赖，以及在微生物宿主（如酿酒酵母）中表达困难、活性低等问题，严重制约了其工业规模的生产效率，先前报道的产量多在每升数十毫克级别，难以满足需求。相比之下，从毛地黄等植物中发现的CYP87A家族酶，能以更简单的结构（与细胞色素P450还原酶CPR协同，定位于内质网）实现甾醇侧链裂解，为高效合成提供了新思路。但植物源P450scc的催化机制尚不明确，在异源系统中也面临转化效率低的关键瓶颈。为了破解这一难题，研究人员开展了一项整合酶工程与系统生物学的综合性研究。
为了开展研究，研究人员运用了多项关键技术方法：
- 1.
计算结构生物学与分子模拟：利用AlphaFold3预测DlCYP87A结构，通过CAVER进行底物通道分析，并采用分子对接与分子动力学模拟研究酶-底物相互作用。
- 2.
酶理性设计与工程：基于结构分析，对底物通道瓶颈位点（如I206, P213）和催化口袋关键残基（如S111）进行丙氨酸扫描及饱和突变，构建并筛选了一系列酶突变体。
- 3.
转录组学引导的细胞器工程：对工程酵母菌株进行RNA测序分析，鉴定出与线粒体、内质网功能相关的差异表达基因（如COR1, ERO1），并对其进行靶向过表达以优化宿主细胞工厂性能。
- 4.
发酵工艺优化与代谢分析：在5-L生物反应器规模进行分批补料发酵，系统研究不同pH（5.0, 5.5, 6.0）条件对菌株生长、代谢物（葡萄糖、乙醇）消耗及孕烯醇酮产量的影响。产物定量采用气相色谱、高效液相色谱-质谱联用等技术。
研究结果
3.1. 筛选用于构建最佳Prn合成途径的P450scc
研究人员系统评估了动物源和植物源P450scc对胆固醇和菜油甾醇途径的底物特异性。结果显示，来自毛地黄的DlCYP87A对菜油甾醇表现出最高的催化活性，产生127.6 mg/L的Prn。截短N端线粒体靶向信号肽对CYP87A活性影响甚微。最终，DlCYP87A被选为后续工程优化的候选酶。
3.2. CYP87A底物进入通道的理性工程
通过对DlCYP87A结构进行通道分析，发现其底物通道在12-16 ?处存在明显瓶颈。对瓶颈附近残基进行丙氨酸扫描，发现I206A突变体（M1）显著提高了催化效率。基于分子动力学模拟识别的动态瓶颈位点，进一步对P213进行饱和突变，获得P213S突变体（M2），其Prn产量提升至189.7 mg/L，且酶结构刚性增强。
3.3. 工程化P450scc在双羟化与侧链裂解之间的功能切换
在优化底物通道后，研究人员聚焦于催化口袋的改造。结构分析揭示了催化口袋附近存在影响底物取向的疏水区和稳定过渡态的氢键区。疏水区改造中，S111L突变体（M4）将Prn产量进一步提高至204.9 mg/L。分子动力学模拟表明，M4比M2具有更稳定的结构和更稳固的底物结合。然而，旨在强化氢键网络的突变（如F281Y, M5）虽然增加了预测的氢键数量，却导致底物与Fe-O催化中心距离增加，并未提高产量。
3.4. 通过转录组为基础的回路设计优化细胞器功能
转录组分析发现，工程菌株中线粒体复合物III组装、能量代谢以及内质网蛋白转运折叠相关基因显著下调。靶向过表达线粒体基因COR1（获得菌株P4）和内质网基因ERO1（获得菌株P5），分别将Prn产量提高至236.2 mg/L和340.7 mg/L。透射电镜观察证实细胞器工程导致了内质网的显著扩增和细胞器整体尺寸的增加。
3.5. 在5升发酵罐中通过pH调控CYP87A功能
由于P450催化的Prn合成高度依赖NADPH，研究假设pH可能通过影响还原力分配来调节代谢流。在5-L发酵罐中测试了三种pH条件（5.0, 5.5, 6.0）。结果显示，在pH 5.5条件下，工程菌株P4表现出最强的生理性能，包括快速的葡萄糖利用、高效的乙醇再同化和强劲的生物量积累，最终在144小时获得了最高的Prn产量，达到1.46 g/L。pH 5.0或6.0的条件均会不同程度地干扰碳通量分布，降低催化效率。
研究结论与意义
本研究成功将植物源P450scc确立为微生物合成孕烯醇酮的高效催化剂。通过整合计算结构生物学、酶理性工程、转录组引导的细胞器优化以及发酵工艺调控，系统解决了植物源P450scc催化机制不明、异源表达效率低的瓶颈问题。
其重要意义体现在多个层面：在科学层面，该研究首次阐明了植物源DlCYP87A酶逐步羟基化-裂解的催化过程中的关键中间体，并通过系统的底物通道与催化口袋工程，厘清了其构效关系，深化了对植物P450催化机制的理解。在技术层面，研究实现了植物源P450scc途径在酿酒酵母中克级（1.46 g/L）孕烯醇酮的从头合成，这是该领域的首次突破，产量达到了工业化应用关注的里程碑水平。在应用与产业层面，这项工作为甾体激素药物前体（如孕烯醇酮）的规模化、绿色生物制造开辟了一条全新的、具有自主知识产权的生产技术路径，降低了传统化学生产或依赖复杂动物源系统的成本和壁垒。此外，研究所展示的“酶机制解析-理性设计-宿主细胞器全局优化”一体化框架，为利用其他植物P450酶或复杂真核生物合成途径生产高价值天然产物提供了可借鉴的合成生物学策略。该研究成果发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊，标志着我国在甾体化合物生物制造基础研究与关键技术开发方面取得了重要进展。
