《Synthetic and Systems Biotechnology》：Modular reconstruction and multilevel regulation of
Saccharomyces cerevisiae to drive the efficient synthesis of asiatic acid
编辑推荐：
为解决传统植物提取积雪草酸效率低、微生物合成存在前体不足、细胞毒性和代谢失衡等难题，研究人员通过代谢工程、拉曼光谱引导的脂滴调控、P450酶优化及线粒体工程等多策略协同，成功构建了高产积雪草酸的酿酒酵母细胞工厂，在5 L生物反应器中实现170.4 mg/L的产量，为三萜类化合物的高效生物合成提供了重要参考。
积雪草酸，一种五环三萜类化合物，因其卓越的抗炎、抗氧化、抗糖尿病和抗肿瘤等生物活性，在功能食品、药品和化妆品领域备受青睐。然而，长期以来，这种宝贵的分子主要依赖从积雪草等植物中提取，过程不仅费时费力，产量也常受限。随着合成生物学的发展，利用微生物“细胞工厂”来“绿色制造”高价值天然产物，成为了一条极具前景的新途径。其中，面包酵母（酿酒酵母， Saccharomyces cerevisiae）因其遗传背景清晰、培养简单、遗传工具丰富，成为了理想的生产平台。但理想很丰满，现实却很“骨感”：当科学家们尝试在酵母中重建积雪草酸的合成路径时，遇到了重重关卡——关键前体供应不足、异源途径引入带来的细胞毒性、核心催化酶（尤其是细胞色素P450）效率低下，以及整个细胞代谢的失衡。这些瓶颈严重制约了产量的提升，距离工业化生产的目标依然遥远。发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上的这项研究，正是为了攻克这些难题，旨在通过系统性的工程学策略，打造一个能够高效、稳定生产积雪草酸的超级酵母菌株。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在菌株构建层面，采用了CRISPR-Cas9基因编辑系统进行精确的基因敲除与敲入，并利用多拷贝基因组整合（如Ty位点整合）策略来增强关键基因的表达。在代谢工程中，运用了启动子强度筛选、蛋白质降解标签（N-degron）技术来精细调控竞争性代谢通量。为应对产物细胞毒性，创新性地结合了拉曼光谱（Raman spectroscopy）进行原位、无标记的产物细胞内分布分析，并以此为指导进行脂滴（lipid droplet）相关基因的工程化改造。在优化核心P450酶催化效率时，采用了血红素（heme）稳态平衡工程和蛋白质融合（含柔性linker）策略。此外，还实施了辅因子（如NADPH）供应平衡和线粒体呼吸链工程，以协调全局代谢与能量供应。发酵工艺则在5 L生物反应器中进行补料分批发酵，并通过动态调控葡萄糖流加速率来优化生产过程。
3.1. α-香树脂醇生物合成途径的构建与优化
研究以高产角鲨烯的底盘菌株SQ1为基础，通过引入来自枸骨的α-香树脂醇合酶（IaAS1）和突变型角鲨烯环氧酶（ERG1V249H/L343A），初步实现了α-香树脂醇的合成。通过筛选不同强度的启动子，发现强启动子PPGK1驱动IaAS1表达效果最佳。进一步将关键基因整合到多拷贝Ty3位点，使产量提升至79.85 mg/L。为减少与内源甾醇途径的竞争，研究人员在关键酶ERG7的N端融合了不同的降解标签（N-degron），其中K15标签能最有效地将代谢流导向目标产物，使α-香树脂醇产量达到137.9 mg/L。此外，通过强化乙醇同化途径基因ADH2和ALD6的表达，补充了合成所需的前体乙酰辅酶A（acetyl-CoA），最终将α-香树脂醇产量提升至159.65 mg/L。
3.2. 脂滴动态调节开关增强细胞适应性
由于三萜中间体的积累具有细胞毒性，研究人员利用拉曼光谱技术首次直观地发现α-香树脂醇主要储存在细胞的脂滴中。基于此发现，他们对脂滴合成与分解相关基因（如DGA1， ARE1， ARE2， YEH1， YEH2）进行了动态调控。实验表明，增强ARE1和ARE2的表达能显著增加α-香树脂醇的积累。进一步将这对基因组合整合到转录抑制子ROX1的基因座，并进行多拷贝整合，最终使工程菌株A28的α-香树脂醇产量达到310.2 mg/L。拉曼光谱对比证实，经过脂滴工程改造的菌株拥有更大、更多的脂滴，从而有效缓解了细胞毒性，提高了细胞适应性。
3.3. 优化关键P450催化效率以促进熊果酸合成
为实现熊果酸（ursolic acid）的从头合成，研究在A28菌株中引入了来自积雪草的C-28氧化酶（CaCYP716A83）和来自拟南芥的细胞色素P450还原酶（AtCPR1）。为改善P450酶的功能，研究人员通过敲除血红素降解基因HMX1并过表达血红素合成途径中的限速酶（如HEM13），来增加辅基血红素的供应，使熊果酸产量提升至140.45 mg/L。随后，他们采用了蛋白质融合策略，将CaCYP716A83与AtCPR1通过不同的柔性连接肽（linker）连接起来，以缩短电子传递距离。其中，CaCYP716A83-GSG1-AtCPR1融合蛋白效果最优。将该融合蛋白编码基因整合到多拷贝Ty4位点后，构建的UA15菌株熊果酸产量达到212.2 mg/L。
3.4. 线粒体与辅因子的协同工程：代谢途径效率的双重驱动
异源途径的引入容易导致细胞氧化还原失衡。为此，研究人员尝试增强胞质NADPH的供应，发现过表达苹果酸酶基因MAE1效果显著，使熊果酸产量增至241.3 mg/L。此外，线粒体作为细胞的“动力工厂”，其呼吸链效率直接影响细胞的整体代谢状态。通过增强线粒体内膜呼吸链复合物IV中细胞色素c（CYC1）等基因的表达，可以有效促进细胞有氧呼吸和碳源利用。最终，工程菌株UA20的熊果酸产量达到了283.3 mg/L。
3.5. 高产积雪草酸微生物菌株的构建
积雪草酸由熊果酸在C-23和C-2α位经羟基化生成。研究以UA20为底盘，引入负责这两个羟基化步骤的酶：CaCYP714E19和CaCYP716C11。通过筛选不同植物来源的CPR，发现来自蒺藜苜蓿的MtCPR与CYP的兼容性最好。为了缩短不同P450酶之间的空间距离，研究人员引入了膜结合支架蛋白（MSBP），如来自拟南芥的AtMSBP1，它能有效促进酶促级联反应，使摇瓶中的积雪草酸产量提升至35.8 mg/L。通过优化发酵条件（如葡萄糖添加量为50 g/L），最终在摇瓶中获得了46.2 mg/L的积雪草酸。
3.6. 5 L生物反应器补料分批发酵
为评估生产潜力，研究在5 L生物反应器中进行了补料分批发酵。通过分阶段动态调控葡萄糖流加速率，以控制乙醇积累，并在接种时添加0.4 g/L FeSO4·7H2O以提供P450酶所需的铁元素，最终在120小时发酵后，积雪草酸的效价达到了170.4 mg/L。
结论与讨论 本研究成功构建了一个用于高效合成积雪草酸的模块化工程酵母底盘。其核心在于通过多层次代谢工程策略，系统性解决了从上游前体供应、中游细胞毒性缓解，到下游核心酶优化及全局代谢平衡的一系列关键科学问题。具体而言，研究通过启动子工程、竞争途径弱化（利用N-degron技术）和乙酰辅酶A回补，大幅提升了关键前体α-香树脂醇的产量。创新性地结合拉曼光谱分析与脂滴工程，可视化并解决了三萜积累的细胞毒性难题，为疏水性天然产物的微生物合成提供了新思路。针对P450酶这一限速步骤，通过平衡血红素稳态、采用融合蛋白策略，有效提升了熊果酸的合成效率。进一步的线粒体工程与辅因子供应协调，则从系统层面优化了细胞的代谢流和能量状态。最终，在这个高度优化的平台上引入下游羟基化酶，成功实现了积雪草酸的从头生物合成，并在5 L规模发酵中取得了突破性产量。这项工作不仅为积雪草酸的工业化微生物生产奠定了坚实的技术基础，更重要的是，它所展示的“从分子机制到细胞工厂”的多层次、模块化工程策略，为解决其他具有细胞毒性的高价值萜类化合物的生物合成难题提供了一个可借鉴的、系统性的工程生物学框架。尽管工业级生产仍面临挑战，但该研究指明的方向——包括对关键P450酶的理性设计与动态调控等——将成为未来进一步突破的重要着力点。
