KLK8通过激活NF-κB和NLRP3炎症小体通路，促进骨关节炎中的软骨降解和焦亡（pyroptosis）现象

《Tissue and Cell》：KLK8 promotes cartilage degradation and pyroptosis in osteoarthritis by activating the NF-κB and NLRP3 inflammasome pathways

KLK8通过激活NF-κB/NLRP3通路促进骨关节炎软骨降解与炎症反应，其抑制可改善疾病进展。实验显示KLK8在OA患者及小鼠模型中显著高表达，通过降解IκBα增强NF-κB活性，同时抑制NLRP3炎症小体相关因子，降低IL-1β诱导的pyroptosis和炎症因子水平。这一机制为靶向KLK8治疗OA提供了新思路。

　　

徐立斌|江泽宇|李海军

南京医科大学附属泰州人民医院骨科，南京医科大学泰州临床医学院，中国江苏省泰州市太湖路366号，225300

摘要

软骨退化、炎症和焦亡是骨关节炎（OA）发病机制的关键驱动因素，这些因素会导致软骨细胞损伤。然而，作为软骨相关蛋白酶的KLK8在OA中的治疗潜力尚未得到充分研究。在半月板/韧带损伤（MLI）诱导的OA小鼠模型和人类OA软骨组织中检测到了KLK8的表达。同时，也在受到白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的软骨细胞中检测并量化了KLK8的表达。使用小干扰RNA（siRNA）抑制了IL-1β刺激的软骨细胞中的KLK8，并研究了其对软骨分解因子和炎症因子表达的影响。探讨了KLK8调节NF-κB活性的机制。还测量了软骨细胞的焦亡情况。通过小鼠的MLI诱导的OA模型来研究KLK8的体内治疗潜力。在OA患者和小鼠模型的关节软骨中，KLK8的表达显著升高。IL-1β刺激体外增加了软骨细胞中的KLK8水平。功能实验表明，敲低KLK8可以减轻IL-1β诱导的炎症反应和软骨细胞外基质的降解。KLK8直接与IκBα相互作用，促进其胞质降解，从而导致p65的释放、核转位和在细胞核中的滞留时间延长，从而增强IL-1β刺激的软骨细胞中的NF-κB活性。此外，在KLK8缺陷的软骨细胞中，IL-1β刺激后NLRP3、ASC和切割的Caspase-1的水平降低，表明其对NLRP3炎性小体的激活具有促进作用。流式细胞术显示，敲低KLK8后软骨细胞的焦亡减少，ELISA检测到TNF-α、IL-6和IL-18的水平降低，表明KLK8调节软骨细胞的焦亡。体内实验表明，敲低KLK8可以减缓OA的进展，并降低OA小鼠中NLRP3、MMP13、COL2A1和IL-18的表达。这些发现表明，KLK8通过激活NF-κB和NLRP3炎性小体途径促进软骨退化、炎症和焦亡。体内实验表明，抑制KLK8可以显著缓解OA的进展，突显了KLK8作为OA潜在治疗靶点的作用。

引言

骨关节炎（OA）是一种普遍的退行性关节疾病，尤其在老年人中更为常见。其特征是一系列渐进性的病理变化，包括关节软骨（AC）的退化、滑膜炎症、软骨下骨硬化以及骨赘的形成（Abramoff和Caldera，2020）。从临床角度来看，OA表现为持续的膝关节疼痛、关节僵硬、活动能力下降，在晚期会导致不可逆的残疾——给医疗系统和社会经济稳定带来重大负担（Allen等人，2022）。尽管导致OA发展的确切机制尚未完全明了，但已确定一些风险因素与其发病和进展有关，如关节创伤、代谢异常、与年龄相关的细胞衰老以及异常的生物力学应力（Dong等人，2023）。值得注意的是，尽管OA的发病率很高，但目前尚无能够改变疾病进程的治疗药物；因此，治疗选择仍然局限于症状缓解或侵入性手术（如关节置换术）（Martina等人，2022）。这凸显了迫切需要揭示控制OA发病机制的分子途径，以便开发能够阻止疾病进展的针对性干预措施。

OA的药物治疗已成为研究的关键领域，抗炎药物和蛋白酶抑制剂在缓解患者症状方面发挥了重要作用。Kallikrein相关肽酶（KLK）家族包含15种进化上保守的丝氨酸蛋白酶（KLK1–KLK15），它们由位于19q13.4染色体上的连续基因簇编码（Filippou等人，2016）。这些酶以无活性的前体形式合成，并经历细胞外的蛋白水解激活，这一严格调控的过程对其在稳态和疾病发病机制中的作用至关重要（Yoon等人，2013）。KLKs参与多种复杂的蛋白水解级联反应，涉及从皮肤病和心血管疾病到神经炎症过程和肿瘤发生（Clements等人，2001）。新的证据表明KLK8在多种组织中具有多功能作用。在中枢神经系统中，KLK8在血肿周围脑组织中的上调会通过放大促炎细胞因子的释放而加剧神经炎症（Tang等人，2023）；而在抑郁障碍中，它会导致海马神经元凋亡（Xu等人，2023）。在肿瘤发生方面，KLK8通过促进结直肠癌细胞的增殖和转移而驱动肿瘤进展（Hua等人，2021）。除了其病理作用外，KLK8还参与生理过程，如突触重塑、认知功能（Shiosaka和Ishikawa，2011）和适应性心脏肥大（Cao等人，2016）。从机制上讲，KLK8对细胞外基质（ECM）动态具有双重影响：它直接切割ECM成分，并间接增强纤溶酶介导的蛋白水解（Rajapakse等人，2005）。值得注意的是，其通过基质金属蛋白酶-20（MMP20）的激活表明，在疾病背景下，KLK和MMP途径之间存在协同作用，尤其是在组织降解和重塑过程中（Yoon等人，2013）。对手术诱导的OA小鼠模型中的软骨蛋白酶进行的全基因组微阵列分析发现，包括Mmp3、Capn2以及两种先前未报道的软骨相关蛋白酶Prss46和KLK8在内的多种蛋白酶显著上调（Bateman等人，2013）。虽然Mmp3和Capn2在OA中的作用已被充分研究，但在关节软骨中发现Prss46和KLK8的表达是一个新发现，因为这两种蛋白酶此前未在该组织中被检测到。Prss46是一种研究较少的丝氨酸蛋白酶，仅被认为与雄性小鼠的生育能力维持有关（Holcomb等人，2020），目前尚无研究探讨其在其他生物系统中的信号通路或功能作用。相比之下，KLK8已在多种病理背景下得到广泛研究，尽管其在OA发病机制中的潜在作用尚未完全探索。值得注意的是，KLK8已知的ECM降解能力，加上其在其他组织中促进炎症和凋亡的作用，提示了它可能通过以下几种机制促进OA进展：（1）直接降解软骨ECM成分；（2）增强软骨溶解；（3）放大局部炎症反应；（4）诱导软骨细胞凋亡。这些潜在机制使KLK8成为值得系统研究的OA发病机制的候选介质。

作为丝氨酸蛋白酶，KLKs通过蛋白酶激活受体（PARs）发挥生物学作用，这是一类普遍表达在细胞表面的G蛋白偶联受体。PARs的蛋白水解激活会启动下游信号级联反应，特别是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通路，这些通路在炎症反应中起着关键作用（Mella等人，2020；Oikonomopoulou等人，2006；Rothmeier和Ruf，2012）。NF-κB是OA进展中的关键通路，它驱动分解因子（MMP-13、ADAMTS5）的上调、合成因子（II型胶原COL2A1）的下调以及炎症细胞因子的产生（Yao等人，2023）。鉴于其已知的蛋白水解活性和这些机制学见解，我们假设KLK8可能通过NF-κB介导的软骨基质降解、持续的炎症反应和软骨稳态的破坏来加剧骨关节炎的进展。

焦亡通过其裂解性和促炎性质显著促进OA的进展（An等人，2020）。这种由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体激活引发的caspase-1介导的细胞死亡途径，会切割gasdermin D并释放成熟的IL-1β（Fang等人，2020；Zu等人，2019）。NLRP3的激活需要：（1）NF-κB依赖的启动和（2）炎性小体的组装（NLRP3寡聚化、ASC招募、caspase-1激活）（Shao等人，2015）。由此产生的NLRP3-ASC-caspase-1复合物驱动炎症细胞因子的成熟并传播焦亡性细胞死亡（Ge等人，2021；He等人，2016）。在OA中，升高的NLRP3炎性小体活性与过度的细胞因子产生相关，加剧了滑膜炎和软骨退化（Li等人，2021；McAllister等人，2018）。虽然多种通路可以激活NLRP3，但其在软骨细胞中的具体调控机制仍不清楚。考虑到NF-κB和NLRP3在炎症中的协同作用（Li等人，2021）以及KLK8已知的促炎功能，我们假设KLK8可能在OA发病机制中调节NLRP3炎性小体的激活。

总之，我们提出了一个机制假设：在炎症软骨细胞中KLK8的上调通过NF-κB激活启动了一个病理级联反应，导致：（1）分解因子（MMP-13、ADAMTS5）的表达升高；（2）合成因子（COL2A1、蛋白多糖）的抑制；（3）NLRP3炎性小体活性的增强。NF-κB和NLRP3信号之间的协同作用放大了促炎细胞因子的产生、细胞外基质的降解和焦亡性细胞死亡——共同加剧了骨关节炎的进展。这项研究将为理解控制软骨退化和软骨细胞焦亡的分子机制提供新的见解，可能揭示改变疾病的新治疗靶点。

部分摘录

人类OA软骨组织

从骨关节炎（OA）患者（n=7）的全膝关节置换术过程中获取了关节软骨样本。这些患者的年龄在60至75岁之间。所有OA样本均使用Mankin评分系统进行了组织学分级（Abedian等人，2013），只有中度至重度OA（评分7–14）的患者被纳入本研究。作为对照，从需要膝上截肢的创伤患者中收集了软骨样本（n=3）。

OA小鼠模型中关节软骨中KLK8表达上调

为了研究KLK8的表达及其在OA中的潜在作用，我们建立了MLI诱导的OA小鼠模型。使用Safranin-O和HE染色来评估关节软骨的糖胺聚糖含量和软骨破坏情况——这是OA病理的两个指标（图1A）。OA组的Mankin评分显著高于假手术组（图1B）。免疫荧光（IF）染色显示，与假手术组相比，OA组中有更多的KLK8阳性细胞（图1C，D）。

讨论

本研究通过体内和体外实验阐明了KLK8在OA发病机制中的作用，旨在明确其在OA关节软骨中的表达及其在软骨退化、炎症和焦亡中的作用。我们的结果表明，KLK8在人类患者和实验小鼠模型的OA关节软骨中显著上调，并且其表达在体外受到IL-1β的诱导。功能实验进一步证实，KLK8促进

结论

我们的研究表明，KLK8是OA中软骨细胞炎症、焦亡和软骨破坏的关键调节因子，这一作用通过NF-κB和NLRP3炎性小体途径介导。这些发现加深了我们对OA发病机制的理解，并强调了KLK8作为疾病修饰治疗靶点的潜力。

伦理批准和参与同意

我们的动物实验方案得到了江苏汉江生物学研究所动物护理和使用委员会的批准（批准编号：HJSW-23022001；日期：2023年2月）。本研究获得了附属泰州人民医院机构审查委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言的原则进行。所有参与者在组织采集前均提供了书面知情同意。

资金

作者声明在准备本手稿期间未收到任何资金、资助或其他支持。

作者声明

所有作者对本文所述的工作和修订过程做出了实质性贡献：徐立斌设计了研究，起草了原始手稿，并根据审稿人的意见进行了修订；徐立斌和江泽宇进行了实验（包括修订中的补充实验）并分析了数据（包括数据重新分析）；李海军监督了研究和修订工作，全面修订了手稿，并批准了最终修订版本。

作者贡献声明

徐立斌：方法学、实验设计、数据管理。江泽宇：方法学、数据管理。李海军：研究监督、数据管理、概念构思。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，未使用生成式AI和AI辅助技术。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

不适用。