基于QbD（量子点生物传感）技术的稳定性指示高效液相色谱（HPLC）方法，该方法结合了卡维地洛（carvedilol）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil），并在跨细胞膜转运系统中实现应用

《Toxicologie Analytique et Clinique》：Stability-indicating HPLC method enabled by QbD based combination with carvedilol and 5-fluorouracil in a transethosomal system

基于QbD设计优化高效液相色谱法，同步测定纳米递送系统中 carvedilol (CVD) 与 5-fluorouracil (5-FU) ，Kromasil C18柱，60:40流动相比例，254 nm检测，线性范围CVD 50-150 μg/mL，5-FU 100-300 μg/mL，检测限3.73/6.08 μg/mL，定量限11.31/18.43 μg/mL，符合FDA标准，适用于抗癌药物递送系统分析。

普拉富尔·辛德（Prafull Shinde）|阿米特·佩奇（Amit Page）

药剂学系，SVKM NMIMS全球大学药学院与技术管理学院，地址：印度马哈拉施特拉邦杜莱（Dhule）424001，孟买-阿格拉国家公路（Mumbai–Agra National Highway）旁古鲁德瓦拉（Gurudwara）后方499号地块02号

摘要

本文建立了一种灵敏、可靠且稳定的高效液相色谱（HPLC）方法，并将其与卡维地洛（Carvedilol，简称CVD）和5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，简称5-FU）结合，用于创新的纳米囊泡跨细胞膜药物递送系统。通过Box-Behnken QbD方法进行方法开发，以系统地实现最佳的色谱性能、足够的分辨率和缩短的分析时间。采用目标分析剖面（Target Analytical Profile，简称TAP）来确定影响其质量特性的关键参数。研究结果表明，有机溶剂的百分比、流动相的pH值和缓冲液的强度是关键影响因素。QbD设计主要评估了关键的分析参数以及适当的控制策略。使用Kromasil C18柱高效分离样品。最终确定的流动相比例为60:40，流速为1 mL/min，在254 nm的等渗点处进行实验。该方法对CVD在50–150 μg/mL浓度范围内以及5-FU在100–300 μg/mL浓度范围内的检测表现出很强的线性响应。CVD的检测限为3.73 μg/mL，5-FU的检测限为6.08 μg/mL和18.43 μg/mL。验证结果符合FDA标准，强制降解实验表明该方法能够区分分析物及其降解产物。因此，该方法适用于需要高精度的先进癌症治疗应用。

引言

鉴于多种癌症治疗模式的协同效应，联合用药是传统单一药物治疗的理想替代方案。此外，联合用药可以降低肿瘤复发的可能性以及减少治疗耐药性的风险[1]。由于卡维地洛（CVD）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的作用机制不同且毒性谱重叠较少，因此可以联合使用[1]。CVD可用于治疗卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、多种黑色素瘤、胶质母细胞瘤、口腔癌和白血病[2]。CVD是一种高效的β-肾上腺素能阻滞剂，IC50值为1 nM，已被重新用于癌症预防治疗[3][4]。CVD是非选择性的β-肾上腺素能阻滞剂，同时具有抗氧化特性，化学名称为1-(9H-咔唑-4-氧基)-3-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙氨基]丙-2-醇。它是一种亲脂性分子，分子量小，对数分配系数（log P）为3.8。由于其极低的水溶性（属于BCS II类药物），因此为这类药物的开发提供了大量机会[6]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种细胞毒性药物，用于对抗多种恶性肿瘤。其化学结构为5-氟-1H-嘧啶-2,4-二酮[7]。5-FU已获FDA批准，可用于治疗多种皮肤问题，如日光性角化病和表浅基底细胞癌。此外，它还被批准用于治疗胃肠道癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠腺癌[8]。这两种药物的结构如图1A和图1B所示。

除了FDA批准的用途（如治疗耐药的白癜风、角化棘皮瘤和由黑色素瘤引起的转移性皮肤病变）外，临床医生还经常使用5-FU治疗各种皮肤相关疾病。有证据表明，对高风险人群进行为期四周的常规5-FU局部治疗可降低鳞状细胞癌的发病率[9]。已有多种分析方法用于测定CVD，包括HPLC–MS/MS、RP-HPLC（结合紫外检测）和常规HPLC[10][11][12]。同样，5-FU也通过LC–MS/MS[13]、HPLC[14]和LC–离子阱质谱[15]进行定量分析。然而，目前尚未有方法同时使用基于质量设计的分析方法来测定CVD和5-FU，尤其是在纳米制剂系统中，这凸显了本研究的必要性和创新性。选择RP-HPLC（结合紫外检测）是因为该方法在法规上被广泛接受，并适用于常规质量控制，同时为未来向LC-MS平台的转换提供了灵活性。

最近的一些分析研究利用LC-MS/MS技术测定血液样本中5-氟尿嘧啶、卡培他滨及其代谢物的浓度[16][17]，指出CVD是非极性分子，而5-FU是极性药物。因此，开发一种同时测定这两种药物的方法存在挑战。影响分析物在峰处保留行为的主要因素是总有机溶剂浓度和盐浓度，以及稀释水溶液中的pH值调整。

迄今为止，尚未有专门针对CVD和5-FU联合测定的方法。虽然已有研究描述了这两种药物在溶液中的单独定量方法，但尚未建立高效、快速的RP-HPLC方法以实现同时检测。本研究通过开发一种RP-HPLC方法填补了这一空白，该方法能够准确且精确地分析囊泡制剂中的这两种药物。所提出的方法符合国际协调委员会（ICH）的规定，证明了其在联合剂型中可靠测定这两种成分的适用性。采用标准的方法论和科学方法能够获得准确且可重复的分析结果。质量设计（Quality by Design，简称QbD）框架有助于系统管理多个分析变量之间的复杂相互作用，从而实现高效的方法优化和建立稳健的控制策略[18][19]。ICH Q14指南的引入，结合ICH Q8和ICH Q11，为分析程序的开发提供了结构化的监管框架。本研究的结果表明，该方法在监管合规性和工业应用性方面表现出色，验证了其适用性、可靠性和效率[20][21]。

经验证的方法为先进分析方法的发展和分析优化提供了坚实的基础，提高了性能和重现性，从而实现了优异的分析结果。采用该指南有望促进行业与监管机构之间的沟通，推动更高效、科学验证且稳健的分析流程，特别是在方法验证协议发生重大变化后[22]。许多研究表明，优化原则可用于开发多种用途的分析方法[23][24]。目前市场上缺乏相应的制剂，这突显了验证分析方法的必要性，以支持药物研发的早期阶段。本研究的主要目标是根据ICH Q14原则，开发并验证一种稳健的RP-HPLC方法，用于同时测定5-FU和CVD。次要目标是证明该方法适用于共载跨细胞膜纳米囊泡制剂的分析，从而验证其在制剂开发、稳定性评估和常规质量控制中的适用性。

材料

CVD由印度特伦甘纳邦海得拉巴（Hyderabad, Telangana）的Carbanion公司提供。5-FU作为赠品样本由印度马哈拉施特拉邦浦那（Pune, Maharashtra）的Thermofischer Scientific公司提供。尼龙膜（孔径0.22 μm）由Globe Scientific公司提供。本研究中使用的所有化学品均具有最高纯度，包括磷酸二氢钾-AR级、盐酸、甲醇-HPLC级和乙腈（99.9%，Sigma-Aldrich，美国）。所使用的化学品和溶剂均为分析试剂和HPLC级。

色谱参数的优化

首先观察了CVD和5-FU的保留模式和色谱性能，与C18柱的固定相和流动相组成比例有关。选择C18柱进行进一步的技术开发，因为它表现出令人满意的色谱分离效果。为了获得更清晰的峰形和可重复的峰对称性，初步实验使用了40:60比例的有机溶剂（乙腈）和水混合溶液。

结论

所提出的方法使用RP-HPLC简单、快速且易于操作，适用于CVD和5-FU的测定。该方法符合ICH建议，显示出高准确性、精确性和稳健性。强制降解测试表明，这两种剂型的降解产物并未影响CVD和5-FU的色谱图。该方法能够有效分离这两种化学物质。因此，该方法的开发具有重要意义。

出版同意

作者同意发表本文。

资金来源（如有）

无。

作者贡献声明

P.S.：负责实际操作、撰写初稿和与期刊的沟通。

A.P.：负责正式分析、修订、数据整理、编辑和提出建议。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者衷心感谢SVKM NMIMS的副院长以及SVKM NMIMS Deemed-to-be University的Mukesh Patel Technology Park Management在项目期间提供的优秀研究设施和鼓励。