《Molecular Cancer Therapeutics》：Targeted Delivery of a Potent STING Agonist Payload via an Antibody–Drug Conjugate Drives Robust Antitumor Activity in Preclinical Models
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本研究探讨了将强效的STING激动剂负载通过抗体偶联药物（ADC）进行靶向递送，以克服传统小分子STING激动剂在肿瘤微环境（TME）中驻留时间短、全身免疫激活毒性大等局限性的新策略。文章报道了开发的一种非可裂解连接子-负载（ncSTING）ADC，在多种临床前小鼠肿瘤模型中均能引发显著的抗肿瘤活性，且相较于系统性给予负载本身，能显著降低全身性免疫激活。研究强调了Fcγ受体（FcγR）结合在某些模型中可增强抗肿瘤活性，但并非必需，为STING激动剂的靶向ADC疗法提供了治疗依据。
文章内容归纳总结
摘要
干扰素基因刺激因子（STING）是先天免疫通路的关键组成部分，能在检测到来自外来病原体或肿瘤细胞的胞内DNA时，激活I型干扰素（IFN）反应。STING信号传导对于抗病毒免疫至关重要，并可被利用来驱动抗肿瘤免疫反应。然而，STING的激活需要精准且受控的激动作用，以在肿瘤微环境（TME）中驱动免疫激活，同时避免有毒的全身性免疫激活。事实上，非靶向的小分子STING激动剂疗法在临床上显示出有限的抗肿瘤活性，这很可能归因于其半衰期短且在TME内滞留性差。本研究假设，通过抗体偶联药物（ADC）将强效的STING激动剂负载直接靶向递送至TME，可能克服这些局限性。本研究报告了一种具有非可裂解连接子-负载（ncSTING）的新型STING激动剂ADC的开发。采用此连接子-负载的肿瘤靶向ADC（ncSTING ADC）在多种临床前小鼠肿瘤模型中引发了强大的抗肿瘤活性。研究发现，Fcγ受体（FcγR）结合会影响抗肿瘤活性，因为在部分肿瘤模型中，具有野生型（WT）Fc的ADC比具有FcγR结合突变型Fc的ADC驱动了更强的抗肿瘤活性。此外，与系统性给予释放的负载相比，肿瘤靶向的ncSTING ADC在引发肿瘤消退的同时，减少了全身性免疫激活。总之，这些数据为通过ADC靶向递送强效STING激动剂负载提供了治疗学依据。
引言
ADC是一种经过临床验证的治疗模式，它利用肿瘤导向性抗体将强效药物负载靶向递送至TME。目前所有FDA批准的ADC均采用通过以下两种机制之一诱导细胞周期停滞和后续凋亡性肿瘤细胞死亡的细胞毒性负载：（i）微管破坏（例如美登素类和奥瑞他汀类）或（ii）DNA损伤（例如喜树碱类、吡咯并苯二氮卓类或卡奇霉素类）。这些机制主要靶向分裂的肿瘤细胞，并且通常对非增殖性或耐药性肿瘤疗效有限。为了服务对这些负载耐药或无效的肿瘤患者，需要具有差异化作用机制的新型负载。新兴策略包括直接杀死肿瘤细胞的细胞毒性负载（例如转录和翻译抑制剂）以及引发免疫介导的肿瘤细胞杀伤的免疫刺激性负载。
癌症免疫疗法的目标是通过抑制免疫检查点（例如抗PD-(L)1药物）和/或激活免疫刺激通路（例如先天免疫激动剂）来增强抗肿瘤免疫反应。靶向T细胞免疫检查点（包括PD-(L)1、CTLA-4和LAG-3）的治疗性单克隆抗体已经彻底改变了癌症治疗，在一部分患者中观察到了有意义且持久的反应。此外，多种先天免疫激动剂——包括靶向TLR7/8、TLR9和STING通路的药物——已被探索，但临床成功有限。目前只有两种FDA批准的先天免疫激动剂，两者均为局部给药：用于治疗膀胱癌的膀胱内给药的卡介苗，以及用于治疗基底细胞癌的局部应用TLR7激动剂咪喹莫特乳膏。其他先天免疫激动剂——包括小分子STING激动剂——无论全身或瘤内给药，都显示出有限的抗肿瘤活性，其中许多表现出肿瘤滞留性差、清除快和剂量限制性全身免疫激活。为了克服这些挑战，人们对靶向方法越来越感兴趣，目前有多款包含TLR7/8、TLR9或STING激动剂负载的ADC处于临床前和临床开发阶段。
本研究旨在探讨肿瘤靶向STING激动剂ADC的治疗潜力。STING是一种先天免疫通路，在感知到来自外来病原体、应激细胞或肿瘤细胞的胞内DNA时，能促进I型IFN和促炎细胞因子的强大产生。STING信号传导驱动强大的免疫反应，这需要精确调控，因为异常的STING信号传导与自身炎症性疾病相关，包括系统性红斑狼疮、Aicardi-Goutières综合征和婴儿期发病的STING相关血管病。此外，急性全身性STING激动在小鼠模型中会导致致命的细胞因子释放综合征（无菌性休克）。我们假设，靶向ADC方法可能通过改善暴露、在TME内集中药物分布以及减少全身免疫激活，来克服小分子STING激动剂观察到的局限性。此假设的关键是确定一种连接子-负载，既能减少全身免疫激活，又能在多种同基因模型中促进强效的STING依赖性抗肿瘤活性。
本文描述了一种新型STING激动剂连接子-负载[非可裂解连接子（ncSTING）]的发现和评估。采用此连接子-负载的肿瘤靶向ADC在多种临床前小鼠肿瘤模型中引发强大的抗肿瘤活性。我们发现，虽然并非必需，但Fcγ受体（FcγR）结合会影响抗肿瘤活性，因为在部分肿瘤模型中，具有野生型（WT）抗体Fc区的ADC比具有FcγR结合突变型Fc的ADC驱动了更强的抗肿瘤活性。我们还证明，与系统性给予释放的负载相比，ncSTING ADC在引发肿瘤消退的同时，减少了外周免疫激活。总之，这些数据为通过ADC靶向递送强效STING激动剂负载（而非系统性给予STING激动剂）提供了治疗学依据。
材料与方法
STING激动剂小分子和ADC的生成
本研究使用的所有抗体均为人IgG1或小鼠IgG2a（mIgG2a）同种型。αCD228抗体是克隆hL49，αB7-H4抗体是克隆B7H41001，αIB6抗体是克隆h15H3或h2A2，αEphA2抗体是克隆h1C1。αCD71抗体克隆是cOKT9，在其重链可变区引入单个N19K取代以去除N-连接糖基化以改善表达。“非结合”指代没有已知结合表位的hIgG1或mIgG2a mAb。图1中所示的所有连接子-负载和释放的负载均按补充方法中描述合成。ADC是通过天然二硫键部分还原，随后与马来酰亚胺连接子-负载进行偶联制备，以生成平均药物/抗体比（DAR）为4的产品。根据需要采用了两种不同的方案（见补充表S1）。偶联方法1：通过与亚化学计量的三（2-羧乙基）膦（TCEP）（通常为2.2当量）孵育，实现IgG1或mIgG2a抗体的部分还原，以平均暴露每个抗体4个硫醇用于连接子-负载偶联。偶联方法2：mIgG2a抗体经历类似的部分还原过程，或完全还原后进行N-乙基马来酰亚胺封端。通过与过量TCEP孵育实现完全还原，然后缓冲液交换至PBS（pH 7.4）和2 mmol/L EDTA中以去除过量TCEP，并暴露每个抗体10个硫醇。完全还原的抗体与平均6个N-乙基马来酰亚胺分子偶联，以平均留下每个抗体4个硫醇用于连接子-负载偶联。偶联后，ADC用硫醇树脂或活性炭纯化以去除过量连接子-负载，并缓冲液交换至PBS（pH 7.4）或类似的中性缓冲液。通过还原型聚合物反相色谱/质谱和天然尺寸排阻色谱/质谱对ADC进行表征以确认DAR，并通过尺寸排阻色谱确认高分子量物质<10%（代表性表征见补充方法）。
THP1双报告细胞实验
使用THP1-Dual细胞和THP1-Dual KI-mSTING细胞评估小分子和ADC的效力，这些细胞含有IRF-Lucia荧光素酶报告基因。细胞在含有指示浓度化合物或ADC的培养基中培养。在铺板后24小时（小分子）或48小时（ADC）收集上清液用于报告基因检测。为了测量Lucia报告信号，将10μL上清液与40μL QUANTI-Luc发光测定试剂在96孔板中混合，并在PerkinElmer EnVision酶标仪上读数。
肿瘤和免疫细胞共培养实验
HT-1080和MDA-MB-468肿瘤细胞用Incucyte Cytolight红色慢病毒转染。活细胞杀伤实验通过接种RFP+ HT-1080或RFP+ MDA-MB-468肿瘤细胞进行。第二天，将从健康供体分离的外周血单个核细胞（PBMC）加入每个孔，并用指示浓度的小分子或ADC处理培养物。使用Incucyte S3活细胞分析系统进行自动细胞成像，并使用Incucyte分析软件进行分析。通过计算96至120小时时RFP+肿瘤细胞的汇合度相对于t=0时的百分比来量化肿瘤细胞杀伤。绘制小分子、ADC（按DAR调整的负载浓度）或未偶联mAb（调整至与ADC浓度匹配）的摩尔浓度图。
小鼠同基因肿瘤研究
所有体内实验均经Seagen机构动物护理和使用委员会批准。从不同供应商购买无特定病原体小鼠，并饲养在无特定病原体屏障设施中。将不同肿瘤细胞系植入小鼠皮下。一旦肿瘤体积达到100 mm3，将小鼠随机分组，并通过静脉内或腹腔内给予单次或三次每周剂量的非结合或靶向ADC。每周两次测量肿瘤体积。将mAb或偶联物的储备浓度稀释至所需浓度。小分子配制在含有40% PEG400的盐水中。
分析小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性
通过基于Guo及其同事报告的临床前数据报告最佳实践的指标AUC（“AUC.3”）评估肿瘤生长，该指标反映了连续生长曲线下的面积并考虑了研究时间。为了确定治疗是否引发了与对照组相比具有统计学意义的抗肿瘤活性，进行单向方差分析检验，然后进行Tukey事后多重比较检验，以比较每个治疗组的AUC.3值。
外周血细胞因子评估
使用MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Multiplex Assay和Luminex MAGPIX仪器系统评估小鼠血浆或血清中的细胞因子水平。
体外细胞毒性
将同基因肿瘤细胞系在96孔板中培养过夜。将测试品的系列稀释液制备在细胞系特异性培养基中，并与癌细胞系孵育96小时。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法根据制造商的说明书测定细胞活力。使用PHERAstar FSX酶标仪测定发光。使用GraphPad Prism 10.4中的非线性四参数曲线拟合模型确定IC50和活力百分比。
结果
STING激动剂连接子-负载的设计与合成
评估了一系列STING激动剂作为潜在ADC负载，包括环状二核苷酸、单体和二聚体小分子。我们确定了先前发表的bis-benzimidazole amide dimers作为一种适合用作ADC负载的强效STING激动剂化学型。我们假设可以在这些STING激动剂二聚体负载的中心口袋内嵌入连接子，而对从抗体释放后的STING结合影响最小。因此，我们开发了一种模块化路线，以高效制备STING激动剂库，并从此库中选择了STING激动剂化合物1（cSTING释放负载）作为可行的起点，以制备三种连接子-负载。我们合成了通过缬氨酸-丙氨酸二肽连接的蛋白酶可裂解连接子（pep-cSTING）、通过葡萄糖醛酸糖连接的葡萄糖醛酸酶可裂解连接子（gluc-cSTING），以及通过马来酰亚胺丙基连接的非可裂解连接子（ncSTING）。包含pep-cSTING和gluc-cSTING连接子-负载的ADC预期在ADC内化和连接子在溶酶体中裂解后释放母体cSTING负载（化合物1）。或者，包含半胱氨酸偶联的ncSTING连接子-负载的ADC在ADC被溶酶体分解代谢后，释放出带有来自抗体的半胱氨酸残基的ncSTING连接子-负载（化合物2）。因此，为了能够直接比较两种释放的负载物种，我们通过ncSTING与半胱氨酸的反应合成了释放的负载，得到ncSTING释放负载（化合物2）。我们通过测量野生型和STING缺陷型小鼠骨髓源性巨噬细胞的IP-10释放，证实了cSTING和ncSTING释放负载的活性都是STING依赖性的。
一种强效STING激动剂ADC的生成
将pep-cSTING、gluc-cSTING和ncSTING连接子-负载偶联到靶向广泛表达的抗原CD71的hIgG1 mAb以及非结合对照mAb上，平均DAR为4。使用THP1-Dual细胞评估这些ADC和相应释放负载的效力。所有三种肿瘤靶向ADC均引发了强效的IFN报告基因活性，其效力比非结合ADC高约15至60倍，表明ADC负载递送是靶点介导的。重要的是，靶向ADC驱动的IFN报告基因活性比相应的释放负载强约130至370倍，这表明ADC能更有效地将负载递送到细胞质中以结合STING，相比之下小分子跨质膜的被动扩散效率较低。最后，我们确认了ncSTING ADC和相应的释放负载对小鼠和人STING具有相当的效力。
接下来，评估了肿瘤抗原靶向STING ADC在体外引发免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤的能力。制备了靶向CD228的ADC，并在由表达CD228的、工程化表达RFP的HT-1080肿瘤细胞和PBMC组成的共培养实验中进行测试。通过使用Incucyte活细胞成像系统量化RFP+细胞汇合度来监测肿瘤细胞杀伤。用STING ADC或相应的释放负载处理共培养物导致了肿瘤细胞杀伤，这与处理的肿瘤细胞单一培养形成对比，表明肿瘤细胞杀伤是免疫介导的。强大的肿瘤细胞杀伤依赖于肿瘤抗原介导的递送，因为CD228靶向的ncSTING ADC驱动的免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤效力比非结合ncSTING ADC或释放负载对照强约100倍。与THP1报告基因实验一致，CD228靶向的ncSTING、pep-cSTING和gluc-cSTING ADC均引发了可比的肿瘤细胞杀伤。
通过使用经慢病毒转导工程化表达肿瘤抗原CD228的小鼠LL2 Lewis肺癌细胞系，在体内进一步评估了连接子设计对抗肿瘤活性的影响。用单次5 mg/kg剂量的CD228靶向ncSTING、pep-cSTING和gluc-cSTING ADC静脉内治疗CD228-LL2肿瘤荷瘤小鼠。与体外观察到的相似肿瘤细胞杀伤形成对比，CD228靶向的ncSTING ADC导致了优于pep-cSTING和gluc-cSTING ADC的抗肿瘤活性。所有ADC均耐受良好，体重变化最小。CD228靶向的ncSTING ADC显示出显著的抗肿瘤活性，而非结合对照则没有，这与体内抗肿瘤活性依赖于STING激动剂负载的靶向递送一致。通过测量小鼠血浆中总抗人IgG水平（即偶联和未偶联抗体）评估ADC的药代动力学特征表明，所有三种CD228靶向ADC在静脉给药后的前4天具有相当的暴露量，这表明抗肿瘤活性的差异并非由抗体暴露量的变化驱动。此外，我们发现ncSTING ADC在给药后6小时驱动的IP-10略少，而在24小时驱动的IL-6和IP-10比cSTING ADC多约2至3倍。鉴于抗体暴露量没有差异但系统药效学效应存在差异，我们假设释放负载的ncSTING（化合物2）与cSTING（化合物1）在吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征上的差异（例如，在免疫细胞中的滞留和/或清除）影响了STING信号传导的幅度和动力学。此外，这提出了ncSTING ADC增强的抗肿瘤活性可能与更持久的药效学/细胞因子反应相关的可能性，尽管需要进一步研究来证明因果关系。尽管未在体内评估非结合ADC连接子-负载的直接比较，但基于在单肿瘤模型中观察到的肿瘤靶向ADC的抗肿瘤活性，我们优先选择ncSTING连接子-负载用于进一步研究评估。
肿瘤靶向STING ADC在多种同基因肿瘤模型和跨靶向抗原中引发抗肿瘤活性
接下来，评估了肿瘤靶向ncSTING ADC在多种免疫活性同基因肿瘤模型（LL2、EMT6、Renca和CT26）和肿瘤抗原（EphA2、CD228、B7-H4和IB6）中引发抗肿瘤活性的能力。测试的同基因模型中，除了Renca细胞在最高测试剂量下显示出适度的敏感性外，没有一种表现出固有的STING敏感性。与CD228、B7-H4和IB6不同，肿瘤抗原EphA2在多种小鼠肿瘤细胞系中内源性表达，因此，在LL2模型中平行运行。用CD228靶向和EphA2靶向的ncSTING ADC治疗CD228-LL2肿瘤荷瘤小鼠引发了强大的抗肿瘤活性。类似地，B7-H4靶向的ncSTING ADC在携带工程化表达鼠B7-H4的EMT6和Renca肿瘤的小鼠中引发了强大的抗肿瘤活性。IB6靶向的ncSTING ADC在携带工程化表达鼠IB6的CT26肿瘤的小鼠中表现出适度的抗肿瘤活性。有趣的是，非结合ncSTING ADC在不同模型中引发了可变的活性，在CD228-LL2模型中没有显著的抗肿瘤活性，而在B7-H4-EMT6、B7-H4-Renca和IB6-CT26肿瘤模型中具有适度的抗肿瘤活性。然而，肿瘤靶向ADC驱动的抗肿瘤活性强于非结合ADC，证明了靶向递送至TME的优势。总之，这表明肿瘤靶向ncSTING ADC在多种小鼠肿瘤模型中诱导强大的抗肿瘤效应，利用了多种肿瘤
