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这篇论文系统探究了pUG折叠四链体(pUG fold)的序列偏好与离子特异性。研究表明，这种独特的左手平行G4结构在维持12个鸟苷的核心要求下，序列具有高度灵活性，且对钾离子(K+)有高亲和力与特异性。研究阐明了pUG折叠形成的分子基础，为理解其在RNAi扩增、基因调控及相关疾病（如癌症、囊性纤维化）中的作用提供了关键的生化与结构学依据。
引言
多聚(UG)重复序列(pUG RNA)是真核生物转录组中最丰富的双核苷酸重复序列之一。研究发现，pUG RNA可以折叠成一种独特的左手平行分子内四链体结构，即pUG折叠。该结构在线虫(C. elegans)中可定向诱导RNA干扰(RNAi)的表观遗传扩增。人类RNA中亦存在成千上万的pUG重复序列，其基因组扩增与包括癌症、囊性纤维化在内的多种疾病相关联。尽管已知最短的形成序列是23核苷酸的(GU)11.5，且其晶体与溶液结构（如(GU)12）已被解析，但关于pUG折叠详细的序列要求与离子特异性此前尚未阐明。本项研究旨在填补这一空白，系统探究pUG折叠形成的精确条件。
结果
pUG折叠的单核苷酸变体
为探究序列要求，研究在一个反向S形六聚体重复单元内创建了所有可能的单核苷酸变体，并通过圆二色谱(CD)和天然凝胶电泳(EMSA)评估其折叠。研究发现，所有鸟苷(G)的取代均导致折叠失败。与此相反，所有尿苷(U)的变体均能正确折叠，其中一些（如U12A）甚至比参考序列(GU)12折叠得更好。U12位于不配对状态，形成跨越四个四联体的单核苷酸螺旋桨环。另一个折叠良好的变体是U8G，其位于结构中的凸出构象位置。令人惊讶的是，对应于U四联体位置的U10变体也能折叠，这表明U四联体可以被破坏或具有足够的灵活性以容纳其他核苷酸。通过CD在304 nm处的负峰强度定量折叠比例，并辅以EMSA验证，数据证实了pUG折叠对U位点变异的宽容性，但对G位点变异高度敏感。
pUG折叠的广泛序列变体
研究进一步探究了包含多个U到A取代的序列变体，包括在所有四个六聚体重复单元的相同位置进行四重U到A取代，以及序列(GA)12。所有RNA均能折叠，并显示出304 nm处特征性的负CD峰，这表明中心G3和G5四联体保持了左手Z-form的syn-anti堆积。其中，凸出核苷酸四重变体(U2A, U8A, U14A, U20A)的280 nm正峰显著减小，但其他特征峰保留。位于U四联体的四重变体(U4A, U10A, U16A, U22A)则能完全折叠并显示出所有4个pUG折叠相关的CD峰。最值得注意的是，(GA)12序列也能形成pUG样折叠，尽管其热力学稳定性（Tm约32°C）显著低于(GU)12（Tm约50°C）。通过EMSA结合G4配体N-甲基-吩嗪鎓(NMM)的结合实验，进一步证实了所有这些变体均能形成G4结构并特异性结合NMM。
pUG折叠的脱氧核糖（DNA）耐受性
研究测试了pUG折叠对脱氧核糖（DNA）取代的耐受性。结果显示，pUG折叠可以容忍部分脱氧核糖的取代。例如，d(G1, G5, T6)x4变体（四个对称位置的G1、G5、T6被脱氧）能够折叠，而d(T2, T8, T14, T20)变体甚至折叠得比(GU)12更好。然而，pUG折叠无法完全由DNA形成，因为d(GU)12和d(GT)12均不能折叠。这表明pUG折叠可以容忍部分脱氧核糖取代，但不能完全由DNA构成，可能与RNA 2'羟基在钾离子(K+)配位中的作用以及糖环构象有关。
pUG折叠形成的离子需求
研究探究了pUG折叠的阳离子依赖性。结果显示，pUG折叠特异性地需要钾离子(K+)，无法在150 mM的钠离子(Na+)或铵离子(NH4+)缓冲液中折叠。钾离子滴定实验拟合希尔方程显示，其表观平衡折叠常数K0.5= 6 mM，希尔系数n = 2.4，表明钾离子的结合具有协同性。添加2 mM的镁离子(Mg2+)并未进一步稳定pUG折叠，多胺（0.3 mM亚精胺和0.4 mM精胺）的存在也不影响其稳定性。即使在模拟生理条件的混合阳离子缓冲液（140 mM K+, 10 mM Na+, 2 mM Mg2+）中，pUG折叠的稳定性也保持不变。
侧翼序列对pUG折叠的影响
研究还探讨了结构化侧翼序列对pUG折叠的影响。构建了四种47个核苷酸长的RNA，其中(GU)12核心两侧连接了不同的序列。结果显示，当侧翼序列能够形成碱基配对（如AU配对、混合配对或基于芒果(Mango)适体的序列）时，能够稳定pUG折叠，其熔解温度(Tm)甚至略高于孤立的(GU)12折叠（54-55°C vs 52°C）。然而，含有随机序列（包含与pUG互补的CA/CAC序列）的侧翼会形成茎环结构，从而完全阻止pUG折叠。这表明pUG折叠的形成和稳定性高度依赖于序列上下文，互补的侧翼序列可促进折叠，而包含互补CA序列的侧翼则会形成竞争性结构从而干扰折叠。
讨论
本研究揭示pUG折叠不限于多聚(UG) RNA。通过系统测试40种序列变体，研究确定了pUG折叠的共有序列在12个鸟苷的核心要求下具有高度灵活性。尿苷可以被任何其他核苷酸单一位点取代，多个U到A的取代也被允许。令人瞩目的是，GA重复序列(GA)12也能形成pUG样折叠，尽管其热力学稳定性较低，这是首次报道GA重复RNA形成左手G4结构。pUG折叠不能由DNA形成，但可容忍部分脱氧核糖取代。该折叠对钾离子(K+)具有高亲和力和特异性，且不受生理浓度镁离子或多胺的影响。此外，侧翼序列可显著调节pUG折叠：互补序列可稳定结构，而富含CA的互补序列则会通过形成竞争性结构来抑制折叠。
基因组分析显示，人类转录组中除超过20,000个完美的(GU)12序列匹配外，还有约4,100个单U到N取代的潜在pUG折叠变体，以及约2,400个GA重复序列。综合估计，人类转录组中可能有高达约27,000个序列具有形成pUG折叠的潜力，数量超过人类基因数。然而，其实际形成高度依赖于避免竞争性的高概率二级结构。在线虫中，pUG尾巴被添加到RNA 3'端，长度可超过100 nt，这为体内折叠提供了理想环境，是招募RNA依赖性RNA聚合酶以合成次级siRNA所必需的。总体而言，这些数据极大地扩展了我们对核酸折叠的理解，表明多种常见RNA序列均可形成pUG折叠，并为改进RNA二级和三级结构预测工具提供了重要的定量框架。
方法
RNA通过T7 RNA聚合酶体外转录合成，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和离子交换层析纯化。折叠分析采用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(EMSA)，并利用NMM荧光检测G4形成。圆二色谱(CD)用于表征折叠结构、测量折叠比例及热力学稳定性（熔解温度Tm）。钾离子依赖性通过CD滴定实验测定，并使用希尔方程拟合。RNA二级结构预测使用RNAStructure在线服务器进行。人类基因组分析基于NCBI RefSeq assembly GCF_000001405.40 (GRCh38.p14)。
