《PLOS Biology》：Ischemic stroke triggers brain-wide synaptic remodeling within four hours
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这篇研究揭示了缺血性中风超急性期（0-24小时）内，一种此前未被认识的快速大脑反应机制。研究发现，在大脑中动脉阻塞（MCAO）后的关键4小时内，大脑不同区域（缺血核心区、半暗带和对侧皮质）展现出特异的突触重塑形式。该研究通过免疫组化、蛋白质组学和转录组学等方法，系统性地描绘了中风后脑内突触的动态变化，证实了N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）信号在协调全脑突触重塑中的关键作用，并提出了“全脑突触再平衡”作为急性中风后快速功能代偿的新机制，为开发新的中风疗法提供了全新视角。
引言：探索中风“黄金时间窗”内的突触动态
作为全球致残和致死的主要原因之一，缺血性中风对公共卫生构成了沉重负担。其中，发病后的最初24小时，即“超急性期”或“黄金时间窗”，对患者的长期功能恢复至关重要。尽管当前治疗侧重于血流恢复，但临床标准仍将大量患者排除在治疗之外。因此，深入理解“黄金时间窗”内的分子、细胞和生理事件，对于开发新的中风疗法至关重要。
在神经系统疾病中，突触功能失调是核心病理因素。虽然突触可塑性在神经发育和神经退行性疾病的早期病因学中已被广泛涉及，但其在早期中风中的作用却鲜为人知。既往研究多关注于离体缺血模型中的广泛突触衰竭或中长期的功能适应与康复，而早期突触重塑过程在很大程度上仍是未知的。为填补这一知识空白，本研究致力于详细描绘缺血性中风发生后的最早阶段的突触可塑性。
研究结果
1. 缺血在体外和体内均触发快速的局灶性突触减少
研究首先在培养神经元中探讨了氧糖剥夺（OGD，一种经典的细胞缺血模型）对突触的影响。免疫染色显示，与对照培养基相比，OGD处理45分钟内，兴奋性突触后致密区（PSD）标记蛋白Homer的斑点状标记即出现丢失。同样，突触前活性区支架蛋白Bassoon（BSN）和抑制性PSD蛋白Gephyrin的斑点状染色也呈类似减少。OGD对抑制性突触的影响比兴奋性突触更强。2小时的OGD处理后，部分突触标记物的斑点数减少，斑点间最近邻距离增加，反映了突触的丢失。这表明，缺血导致了培养神经元中突触的快速解离。
为更全面地模拟中风病理生理学，研究采用了可较好再现人类中风形态和生理特征的大鼠永久性大脑中动脉阻塞（MCAO）模型。正如预期，MCAO可靠地在皮层产生大面积坏死病灶。在缺血核心区，所有三种突触标记物在MCAO后4小时内均表现出显著下降，这与OGD模型的观察结果一致，表明缺血与兴奋性和抑制性突触的快速破坏有关。在半暗带，Homer的斑点也减少了。MCAO还降低了缺血核心区和半暗带中聚合的F-肌动蛋白（F-actin）的突触水平，这支持了快速突触重塑的观点。这些发现共同证明，中风能迅速导致缺血核心区的深度突触丢失以及半暗带的某些突触减少。
2. 中风在体内诱导长程突触重塑
中风后的中长期恢复过程已知涉及全脑功能连接的重新塑造。为研究超急性中风对突触可塑性的长程影响，研究测量了中风对远离缺血核心区（0.5-1厘米）的对侧皮质中突触标记物的影响。引人注目的是，MCAO后仅1小时，对侧皮质的Homer和BSN斑点状染色就显著增加。而Gephyrin斑点并未伴随增加，表明结构性突触增大可能仅限于兴奋性突触。Homer和BSN阳性斑点的数量没有显著改变，这与现有突触的增大而非新突触的生成相符。
3. 缺血诱导的区域特异性突触重塑
为更深入了解中风期间的快速突触重塑，研究对几类关键的突触蛋白进行了免疫染色。对于突触后受体，研究了AMPA型谷氨酸受体亚基GluA2和GABA受体亚基GABRA1的分布。OGD在15分钟和45分钟内分别导致GluA2和GABRA1斑点的快速丢失。在MCAO模型中，也观察到了类似结果：核心区的GluA2和GABRA1分别在1小时和4小时内减少；在对侧皮质或半暗带未观察到显著变化。这些数据表明局部缺血导致了突触后功能的快速下降。
为研究中风对突触前结构和功能的影响，对脑切片进行了P/Q型电压门控Ca2+通道（VGCC）CaV2.1和突触小泡（SV）标记蛋白囊泡谷氨酸转运体vGlut1的免疫标记。研究发现MCAO不影响CaV2.1的染色，而vGlut1在缺血核心区4小时后增加。为直接测量突触前功能，在MCAO后制备急性脑切片，并使用针对突触小泡标记蛋白Synaptotagmin 1（Syt1）胞外域的抗体进行活体标记。抗Syt1标记在核心区和半暗带均显著减少。这些发现共同表明，缺血快速下调了局部的突触前和突触后功能。
4. NMDAR信号调控快速突触重塑
研究旨在确定超急性中风时长程突触可塑性的信号机制。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）是包括中风在内的神经系统疾病中突触可塑性的关键调节因子。基于先前关于缺血期间NMDAR表达的线索，对OGD和MCAO后突触NMDAR的分布进行了成像。OGD对必需NMDAR亚基GluN1的突触水平没有显著影响，在MCAO期间，整个大脑区域的GluN1水平也没有显著变化；对于另一个与中风和神经保护相关的NMDAR亚基GluN2B也观察到类似结果，这表明超急性中风的时间尺度与突触NMDAR的募集无关。
为研究NMDAR信号对突触重塑的功能相关性，研究人员给动物注射了NMDAR拮抗剂MK801（在该模型中具有神经保护作用），然后进行MCAO，并对Homer和BSN进行染色。在MCAO前注射MK801导致半暗带和对侧半球的Homer斑点状染色均减少，有效地逆转了对侧半球的长程增加；BSN染色也观察到类似结果。这一证据表明，NMDAR信号在超急性中风期间以区域特异性的方式协调着全脑范围内的快速突触重排。
5. 突触体的蛋白质组学分析证实了长程突触重塑
为更广泛地了解超急性中风期间的突触动力学，研究利用定量蛋白质组学鉴定了经过4小时MCAO后，经生化纯化的脑突触体中差异表达的蛋白质。主成分分析（PCA）显示，缺血核心区和半暗带在一侧，对照和对侧皮质在另一侧，这表明中风在直接受缺血影响的区域引起了突触组成的深刻变化。来自核心区和半暗带的突触体，其下调蛋白质的数量远多于上调蛋白质（分别为580对210和373对146），这与缺血中普遍的突触减少一致。而在对侧突触体中，上调和下调的蛋白质数量相似（88对93），这与突触重塑的观点一致。区域表达谱之间存在一定重叠，表明出现了全脑性以及局部的反应。
研究更详细地关注了对侧突触重组。基因本体（GO）分析显示，在与突触可塑性相关的生物过程和分子功能术语方面有富集，而顶级的细胞成分术语则与突触定位相关。这些结果通过基因集富集分析（GSEA）得到证实，返回了与突触前膜运输相关的术语。相比之下，下调蛋白质的GO术语更为多样，通常与代谢和膜运输有关，在细胞成分类别中细胞核显著富集，表明可能存在位于细胞核的非突触反应。在88个上调蛋白质中，有35个先前被GO术语与突触相关联，包括突触后功能、突触前释放、离子转运和细胞外粘附，其中电压门控K+通道增加尤为显著，这是神经元兴奋性和突触可塑性的关键调节因子。增加最多的蛋白质是β-突触核蛋白（β-Synuclein），先前曾被建议作为中风的生物标志物。其他值得注意的上调蛋白包括中间丝的主要蛋白波形蛋白（vimentin），以及与内源性大麻素信号相关的9种蛋白质，包括负责2-花生四烯酸甘油（2-AG）代谢的两种酶Mgll和Dagla。这些证据共同证实了在超急性中风期间对侧半球的突触上调。
相反，在缺血核心区和半暗带未观察到突触增加。在核心样本中，上调的GO术语富集于质膜定位，而下调的术语是细胞核和细胞质，这可能表明由于缺血诱导的坏死导致了细胞区室崩解造成的污染。在半暗带的GO分析表明，线粒体中的脂肪酸β-氧化上调，而细胞质中的翻译下调。
为研究对侧皮质的突触前功能，将活体标记抗Syt1测定应用于突触体。鉴于先前证据显示本构性突触小泡循环没有增加，研究采用高K+去极化来测量诱发性突触小泡循环。用抗Syt1对突触体进行表面标记显示假手术对照组和MCAO组之间没有差异，表明Syt1的表面水平没有变化。然而，用30 mM KCl处理导致从MCAO对侧皮质纯化的突触体信号显著更高，表明诱发性突触小泡循环增加。这些数据证实了中风对全脑突触前功能的长程影响。
6. 超急性中风期间突触中区域特异性的基因表达程序
研究数据揭示了响应超急性中风的区域特异性突触重组模式。为揭示相关的基因表达动力学，研究人员从全脑组织和突触体中分离、测序并分析了总RNA。全脑组织数据的PCA显示出显著的离散性，这与脑基因表达的个体间变异性一致。相反，突触体样本的PCA返回了对照、缺血核心区和半暗带之间的清晰分离，表明中风触发了大规模、独特的、区域特异性的突触基因表达程序的产生，而对照和对侧样本重叠，表明基因表达谱差异很小。
研究首先对突触体进行了基因集变异分析（GSVA），使用了先前发表的突触基因集。在对侧半球样本中未观察到变化，这表明对侧半球的突触重塑可能不是由局部基因表达驱动的。相反，来自缺血核心区的样本显示突触后基因集的特定下调，而来自半暗带的突触体中的大多数突触基因集都下调，表明了对局部突触基因表达的影响。对突触基因集的影响在半暗带的全脑样本中也很明显。
为了进一步了解早期中风期间受基因表达调控的生物学过程，研究使用基因本体（GO:BP, GO:MF, GO:CC）和KEGG术语进行了GO分析。在半暗带，上调基因参与各种生物过程的调节，主要与发育和免疫反应相关，突出了对中风反应的广泛重组，而下调的术语包括突触和细胞间通讯，这与GSVA结果一致。在对侧半球，突触体和全脑组织的基因分别在与代谢过程和补体系统相关的术语上显示出上调。在缺血核心区，全脑组织中下调的基因在转录相关术语中富集，而突触体中下调的基因则在突触和细胞粘附相关的术语中富集。综上所述，研究数据表明超急性中风诱导了广泛的区域特异性基因表达程序。
讨论
快速的对侧突触重塑
本研究的关键发现是中风对对侧半球兴奋性突触的影响，出现在中风发作后4小时内。先前发表的关于2天以上对侧功能改变的证据尚无定论，这表明对侧增强可能是与中风超急性期特别相关的短暂特征。将突触功能从核心区/半暗带重新定向出去，可能代表了一种早期阶段的反应机制，以保障全脑功能。在更长的时间尺度上，远端大脑活动的增加可能提供刺激，促进中风区域环路的功能恢复。对侧上调的广泛弥漫性质让人联想到一种稳态机制，其时间尺度类似于氯胺酮和锂诱导的可塑性，其作用先于中风较慢的长程神经元可塑性。我们的蛋白质组学和转录组学分析突出了与长程突触可塑性相关的特定功能，包括膜电位、大麻素信号和突触前功能，后者已通过实验直接证实。考虑到研究调查的时间尺度有限，在调查中发现的88个对侧上调蛋白质可能只是随后更广泛变化的先兆。在对侧半球观察到的有限基因表达变化表明，突触重塑可能以跨脑的方式从缺血核心区和半暗带产生影响，在这两个区域，我们发现了一个以代谢重组和突触下调为中心的转录/翻译反应。类似的代谢转换，即减少蛋白质生物合成和增加脂质代谢，先前已在心脏中得到证实，这表明对缺血的代谢适应存在广泛的共性。考虑到突触传递的巨大能量需求，可以推测区域突触重塑和代谢转换可能协同作用，以在中风期间平衡功能与组织活力。
有趣的是，长程突触效应的发现唤起了“神经功能联系不能”（diaschisis）的概念，即指局部脑损伤导致远端大脑区域的功能变化。在这一框架下，突触可塑性可被解释为神经功能联系不能的基质，为中风的广泛脑效应提出了新的机制。长程突触反应是否在创伤、肿瘤或感染导致的其他形式的脑损伤中发挥类似作用，仍有待观察。
全脑突触重组的信号机制
研究表明，全身性给予NMDAR拮抗剂MK801会破坏MCAO诱导的突触重塑，突显了NMDAR在协调早期中风全脑代偿性突触反应中的关键作用，并揭示了NMDAR在脑部疾病中所扮演的复杂作用的一个新方面。与MCAO期间核心区和半暗带细胞外谷氨酸浓度快速增加的报道一致，NMDAR的激活可能局限于缺血区域。有趣的是，数据显示，在NMDAR阻断期间进行MCAO会导致对侧突触减少，这表明中风中的NMDAR信号可能不仅启动了一条用于突触增强的长程通路，而且还抑制了另一条用于突触弱化的机制。关于MK801对体温缺乏影响的情况，在MK801处理的假手术对照组中观察到的突触染色增加与NMDAR阻断触发的快速增强一致，而非发热诱导的突触增强。由于NMDAR在大脑中的广泛表达谱，证据无法单独评估突触、突触外或非神经元NMDAR的贡献，它们可能在中风中以不同方式参与；因此，NMDAR对这种长程中继的相关性值得进一步研究。
蛋白质组学分析提示了另一条信号通路在突触再平衡中的可能作用，即大麻素信号通路。对侧半球大麻素信号成分的突触表达增加，可能通过多种形式的可塑性来调节突触动力学，而半暗带突触中大麻素受体1水平的增加可能促进先前与中风相关的促生存通路的激活。广泛的突触重塑可能与介导大麻素神经保护特性的局部机制协同作用，增强大脑对中风的整体恢复力。
研究局限性
研究的主要局限性涉及特定中风模型的使用。永久性MCAO模型虽然被中风治疗学术产业圆桌会议推荐，但无法涵盖人类中风的多个关键特征，最显著的是其病理生理异质性，以及缺血和内皮损伤过程之间复杂且知之甚少的相互作用。因此，本研究的结果为在其他动物中风模型以及最终在人类患者中进行进一步研究提供了依据，需要特别注意年龄和性别等因素。
由于实验设计的考虑，研究重点关注了1、2和4小时的时间点，这与临床对超急性中风的普遍定义一致。因此，没有考虑更快或更慢形式的突触动力学，例如赫布可塑性或小胶质细胞的吞噬作用。涵盖更广泛时间尺度的扩展调查可能会提供中风突触动力学更详细的图景；就此而言，对即早期突触重塑的研究可能适用于活体成像方法，以更近距离地观察临床上重要的中风第1小时。
对侧突触前末梢突触小泡循环增强的证据，需要对观察到的效应进行更详细的功能评估。虽然突触小泡测定代表了评估一般突触功能的有效指标，但突触在脑部疾病中的性质可能很复杂，其不同功能方面受到不同程度的影响。此外，长程突触重塑在多大程度上构成代偿机制与中风后遗症仍不清楚。需要对超急性中风的全脑突触功能进行专门的系统性研究来解决这些问题。
未来方向
本研究的结果提出了许多关于早期中风突触可塑性的问题。代谢反应如何与突触重组相耦合？衰老如何影响中风诱导的突触动力学？快速突触重塑的哪些方面有助于大脑对中风的反应，哪些又代表了其不良后果？在更广泛的背景下，早期突触参与的构想与关于其他脑部病理学的既定论述相一致，为在脑血管疾病（包括创伤性脑损伤、短暂性脑缺血发作和出血性中风等急性神经系统疾病）中进一步研究突触可塑性提供了动力。
研究结果的临床相关性仍有待确定，因为缺乏关于早期人类中风突触动力学的证据。虽然在临床环境中直接研究人脑突触在实验上仍然具有挑战性，但最近发表的关于中风对侧功能增强的脑电图证据表明，类似的机制可能在人脑中起作用。经过进一步研究，从长远来看，靶向突触可塑性可能为改善中风“黄金时间窗”内及以后的临床结果提供急需的新治疗方式，这与治疗神经退行性和神经发育疾病早期阶段的新兴突触疗法相平行。
