金属-酚醛网络包封动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp. animalis BB04）：一种简便的单细胞包封方法，可提高其在冰淇淋应用中的存活率和益生菌活性

《Food Bioscience》：Metal-phenolic network encapsulation of Bifidobacterium animalis subsp. animalis BB04: A facile single cell-encapsulation strategy for enhanced viability and probiotic properties of probiotic in ice cream applications

益生菌在食品加工中的存活率问题通过金属酚网络（MPN）材料解决，采用羧甲基壳聚糖-原花青素接枝与钙离子自组装形成新型MPN结构，成功封装乳杆菌BB04并提升其耐胃酸、胆盐及低温能力，最终在冰激凌中实现180天-20℃储存存活率稳定在6.0 log CFU/g以上。

　　

刘琦|杜静|匡宏|王月|郭天琪|刘国荣

北京工商大学食品与健康学院，北京，100048，中国

摘要

益生菌对人类健康至关重要，但它们在食品加工和应用过程中的低存活率仍然是一个需要解决的重大挑战。在本研究中，将羧甲基壳聚糖-鞣花酸接枝物（CMCS-EA）和Ca²⁺自组装成金属-酚类网络（MPN）。然后使用MPN有效包封厌氧菌（Bifidobacterium animalis亚种animalis BB04），旨在显著提高其对恶劣环境条件（如胃酸、胆盐和低温）的耐受性及其益生菌特性。结果表明，MPN表现出优异的耐胃酸降解能力，有效保护了B. animalis亚种animalis BB04免受胃酸、胆盐和低温的损害，从而显著提高了其存活率，并显示出更好的细胞粘附能力。基于此，将包封的B. animalis亚种animalis BB04添加到益生菌冰淇淋中。BB04@CMCS-EA-Ca²⁺不仅显著降低了冰淇淋的膨胀率和融化率，更重要的是，在-20°C下储存180天期间，保持了B. animalis亚种animalis BB04的活性，使其活菌计数始终高于6.0 log CFU/g。本研究不仅提供了一种高效且多功能的包封策略来传递高活性的益生菌，还展示了其在开发稳定冷冻益生菌功能性食品方面的巨大应用潜力。

引言

益生菌是在足够摄入量下能够促进宿主健康的活微生物（Sanders等人，2019年）。乳酸菌（LAB），尤其是厌氧菌，在加工、运输和储存过程中会受到多种不利条件的影响，包括低pH值、高温和氧气（Peruzzolo等人，2025年）。为了提高LAB的存活率，通常采用多细胞包封技术来保护益生菌免受环境压力的影响。在多细胞包封中，大量益生菌细胞被作为一个统一的群体共同包封（Yuan等人，2024年）。这种策略在可扩展性和生产简便性方面具有实际优势。然而，这种方法存在固有的局限性，包括包封效率低以及暴露于加工引起的外部有害压力，如低pH值、高温和冷冻应力，导致益生菌颗粒过大、形状可控性差、易泄漏等缺点（Zhao等人，2024年）。这些局限性凸显了需要更精确和高效的包封策略以实现更好的保护和控制益生菌的释放。

在这种情况下，食品纳米技术成为益生菌包封的强大工具，为解决益生菌稳定性相关问题提供了有希望的策略。单细胞包封使用纳米胶囊、纳米乳液、纳米脂质体和纳米颗粒等方法在单个益生菌上创建纳米级涂层。Pan等人（2022年）证明，由单宁酸（TA）和铁离子（Fe³⁺）形成的金属多酚网络（MPN）的单细胞包封结构可以有效保护益生菌免受抗生素的侵袭。Liu等人（2023年）的研究表明，将单个益生菌包封在玉米醇溶蛋白纳米颗粒（ZNP）和果胶的复合物中，由于果胶层的保护作用以及ZNP的改善储存稳定性，益生菌的热耐受性得到了提升。Feng等人（2020年）使用阴离子肠聚合物L100-55进行单细胞包封，以保护Escherichia coli Nissle 1917（EcN）免受消化道环境的影响。因此，单细胞包封不仅能够为单个细胞提供纳米级保护涂层，还能有效提高益生菌的存活率，保护它们免受不利环境条件的影响。

在各种单细胞包封方法中，MPN因其易于自组装、多功能性和生物相容性而脱颖而出，成为广泛采用的益生菌和生物活性化合物包封平台（Wang等人，2022年）。含有儿茶酚官能团的酚类化合物普遍存在，并以其多功能的金属螯合能力而闻名（Ju等人，2015年）。多酚和金属离子的协同组装形成了MPN。然而，MPN在低pH条件（pH < 3.0）下的稳定性有限，主要是由于质子导致金属离子和酚类配体之间的配位键解离（Xia等人，2024年）。MPN对低酸性环境的敏感性仍然是提高益生菌生物利用度的主要障碍。MPN的形成依赖于多酚和金属离子之间的配位键。这种不稳定性源于在低pH下质子（H⁺）对酚类配体的竞争性结合，破坏了金属-酚酸盐的配位。这种酸诱导的解体严重限制了MPN涂层在恶劣胃肠道环境中的保护能力。

最近，基于MPN的几种创新单细胞包封策略被提出以提高益生菌的存活率（Xie等人，2025年）。例如，利用TA-Ca²⁺复合物和粘蛋白的逐层自组装创建了“超级益生菌”，以EcN为模型菌株，保护益生菌免受恶劣胃肠道环境的影响并提高存活率（Yang等人，2022年）。同样，Xie等人（2025年）将Fe³⁺固定在EcN表面，通过与TA的自组装形成MPN壳，然后沉积羧甲基β-葡聚糖构建了装甲益生菌，从而在低温条件下提高了益生菌的存活率。Zhu等人（2024年）报告称，通过在细菌表面构建透明质酸功能化的金属-酚类网络涂层，提高了益生菌在恶劣胃肠道环境中的存活率。这些方法，特别是后者添加了独特的多糖层，体现了“二次涂层”策略。这种范式依赖于对益生菌细胞的外部强化，通常涉及多步骤过程，并可能引入影响生物相容性的界面。更关键的是，这些方法并没有从根本上解决保护涂层本身在恶劣条件（如酸性胃肠道环境）下的脆弱性问题。任何基于MPN的包封效果都取决于金属-酚类配位网络的内在稳定性，尤其是对酸的稳定性。常见的提高MPN酸稳定性的策略包括应用二次物理涂层和筛选更稳定的多酚-金属配对（Wasuwanich等人，2022年）。虽然这些方法有益，但它们主要关注外部添加或现有化学空间内的选择，可能无法完全解决核心稳定性问题。因此，我们提出从“外部强化”向“内部核心增强”转变的范式。我们直接在分子水平上工程化了主要配位配体（Xu等人，2022年）。

从健康百岁老人的粪便中分离出的Bifidobacterium animalis亚种animalis BB04能够产生多种代谢物，并在食品保存中表现出明显的益生菌特性。然而，作为一种专性厌氧菌，这种菌株对加工和储存非常敏感，严重限制了其实际应用。为了克服这些限制，我们提出了一种更简洁且本质上更稳定的方法：将多酚直接共价接枝到羧甲基壳聚糖（CMCS）上。这种设计的目的是在分子水平上增强MPN核心的耐酸性，利用CMCS作为成熟的包封材料的优势，同时避免需要额外的涂层。在这里，开发了一种新型的自组装细胞涂层，以提高B.animalis亚种animalis BB04的活性和稳定性，并探索其在益生菌冰淇淋中的应用。首先，将CMCS与五种多酚接枝以增强稳定性。随后制备了B.animalis亚种animalis BB04单纳米涂层（BB04@CMCS-EA-Ca²⁺）。进一步评估了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的益生菌特性和环境应力耐受性。最后，在冰淇淋模型中评估了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的关键性能属性，包括加工耐受性、冷藏稳定性和模拟的胃肠道消化耐受性。本研究提供了一种在酸性条件下提高MPN稳定性的新方法，为改善Bifidobacterium在各种恶劣环境中的存活率和发展新型功能性食品提供了新的见解。

材料

单宁酸（TA）、鞣花酸（EA）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）从 Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）购买。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、（?）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、原儿茶酸（PCA）、没食子酸（GA）、羧甲基壳聚糖（CMCS）和胆盐从 Macklin Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）采购。氯化钙（CaCl₂）和氯化钠（NaCl）从 Fuchen Co.,

多酚化合物形成MPN的能力分析

MPN的一个明显局限性是在低pH环境（pH < 3.0）下的不稳定性（Xia等人，2024年），这可能导致快速的结构崩溃，使益生菌暴露在恶劣环境中，并导致益生菌存活率显著下降。在本研究中，为了提高MPN的稳定性，通过将其与CMCS接枝来修饰选定的多酚。修饰的目标是五种多酚：单宁酸（TA）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸（GA），

结论

本研究开发了一种用于B. animalis亚种animalis BB04单细胞包封的新型金属-酚类网络（CMCS-EA-Ca²⁺。通过SEM和TEM确认了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的成功制备。包封的益生菌表现出对低温、氧气、胃肠道传输和胆盐的增强耐受性，以及由于保护性交联基质对细胞的屏蔽作用而改善的细胞粘附性。

CRediT作者贡献声明

刘琦：撰写——原始草稿，数据管理，概念构思。杜静：撰写——原始草稿，数据管理，概念构思。匡宏：形式分析。王月：可视化。郭天琪：研究。刘国荣：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

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  引言和目的

益生菌冰淇淋感官评估的核心目的是系统地评估产品的感官质量是否符合消费者的

利益冲突声明

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致谢

该项目由北京自然科学基金（编号：6252001）和中国自然科学基金（编号：31871772）资助。