《Hormones and Behavior》：Acute and chronic extreme cold weather events influence hypothalamic and testicular gene networks in a free-living Arctic breeding songbird, the Lapland longspur
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北极云雀在极端天气下的繁殖期HPG/HPA轴激素调控及基因表达网络研究，通过对比2013年慢性低温与2016年典型及暴风雪天气下的生理响应，发现抵达期低温导致性腺抑制和HPA轴激活，孵卵期暴风雪仅引起HPA轴应激反应，且网络共表达结构随环境压力动态重组。
Jesse S. Krause | Angus M.A. Reid | Jonathan H. Pérez | Jeffrey C. Cheah | Valerie R. Bishop | Violeta Trejo-Reveles | Alex R. Johnston | John C. Wingfield | Simone L. Meddle
内华达大学里诺分校生物系，美国内华达州89557
摘要
本研究探讨了雄性拉普兰长刺雀（Calcarius lapponicus）在繁殖阶段特有的内分泌表型及其对急性和慢性极端天气反应的调控机制。在2013年春季极端寒冷的季节，这些鸟类在到达阿拉斯加繁殖地的时间延迟后被采集。而在2016年，当天气条件正常时，我们在它们到达繁殖地以及孵化期间（无论是否遭遇暴风雪）对它们进行了采集。我们量化了下丘脑和性腺的基因表达、类固醇激素以及睾丸体积，以表征不同繁殖阶段的激活和抑制信号通路。在鸟类到达繁殖地时，网络共表达模式具有很强的结构特征，下丘脑、睾丸抑制和睾丸激活信号模块之间存在明显的功能分离。在孵化期间，这种功能分离减弱，在极端寒冷条件下则完全消失，反映出模块间的整合程度增加。从到达繁殖地到孵化的转变过程中，边缘水平的共表达发生了显著重组，表明激素和基因之间的连接发生了变化。在正常条件下，从到达繁殖地到孵化的转变伴随着下丘脑促性腺激素抑制激素（GnIH）和芳香化酶、促性腺激素受体、类固醇生成酶以及循环中睾酮水平的下降，而睾丸中的皮质类固醇信号相关基因则保持稳定。在到达繁殖地时遭遇的长期寒冷天气则导致下丘脑中的2型脱碘酶和雌激素受体水平升高，同时降低下丘脑中的GnIH、睾丸体积和血浆睾酮水平。孵化期间的暴风雪导致下丘脑中的TSHβ和芳香化酶水平升高，但睾丸未发生明显变化。我们的研究为了解极端天气如何影响野生动物的内分泌表型提供了新的见解。
引言
在气候变化迅速、极端天气事件频率不断增加的背景下，动物面临着可能考验其行为和生理适应能力的环境挑战（Smith, 2011; Wingfield et al., 2017）。有许多记录显示，当地鸟类种群因无法应对极端天气而出现繁殖失败（Martin and Wiebe, 2004）。下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴整合了初始信号（如光周期）和补充信号（如食物可用性、社会信息等），以微调繁殖开始的时间或在中断繁殖尝试后重新启动繁殖（Wingfield, 2008）。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴对于应对不可预测的事件（如风暴）至关重要，并能抑制HPG轴的活动（Wingfield and Sapolsky, 2003）。在HPG轴的背景下，理解以下两种情况下的内分泌变化至关重要：1）在繁殖阶段正常过渡期间；2）在这些阶段中发生急性或慢性寒冷天气时。
对于长日照繁殖的动物而言，繁殖轴在日照时间延长时被激活，这一过程通过局部甲状腺激素信号级联反应实现，涉及甲状腺刺激激素β（TSHβ）以及2型和3型脱碘酶（DiO2和DiO3）的相互作用，从而解除对促性腺激素释放激素（GnRH-1）分泌的抑制。GnRH-1和促性腺激素抑制激素（GnIH）调节垂体前叶释放的促黄体生成激素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）（Dawson, 2015; Wingfield et al., 2016）。这些促性腺激素促进性腺的复苏、精子生成以及雄性激素睾酮和雌性激素雌二醇的合成。睾酮的合成需要一系列酶的参与，包括胆固醇酯酶（CEase）、类固醇生成急性调节蛋白（StAR）、侧链裂解酶（SCC）、3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）、17/20裂解酶和17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）（Tremblay, 2015）。睾酮和雌二醇通过作用于大脑中的受体来刺激繁殖行为，如鸣叫、领地攻击性、交配等。此外，睾酮和雌二醇还通过负反馈机制调节HPG轴的活动，以限制其活性（Lawson et al., 2001）。
在面临恶劣条件时，HPA轴被激活，导致糖皮质激素（如皮质酮）水平升高，后者可通过复杂的细胞信号系统抑制HPG轴。局部表达的皮质类固醇结合球蛋白（CBG）可以调节皮质酮向目标组织细胞的输送（Schoech et al., 2013; Sun et al., 2018）。此外，11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）可增加细胞内皮质酮浓度，而11β-羟基类固醇脱氢酶2型（11β-HSD2）则降低其浓度（Chapman, Holmes & Seckl 2013）。基因表达最终受细胞内糖皮质激素受体（GR；低亲和力）和盐皮质激素受体（MR；高亲和力）的调控（MR; de Kloet, 2014）。FK506结合蛋白51（FKBP5）可以与GR和热休克蛋白90（HSP90）在细胞质中形成复合物，从而抑制GR的信号传导和活性（Zimmer et al., 2020）。皮质酮的最终信号效应包括降低下丘脑中的GnRH水平以及提高下丘脑和睾丸中的GnIH含量（Calisi et al., 2008; Kirby et al., 2009），进而抑制睾丸中的睾酮和精子生成（McGuire and Bentley, 2010）。多项近期研究表明，鸟类性腺中的基因表达在急性寒冷压力、应对压力或皮质酮植入等情况下会发生广泛变化（Lipshutz et al., 2022, Calisi et al., 2018, Austin et al., 2021）。
幸运的是，我们能够在阿拉斯加北极地区，研究雄性拉普兰长刺雀（Calcarius lapponicus）在自然繁殖阶段表型和行为转变过程中，以及它们如何受到急性和慢性寒冷天气事件的影响。拉普兰长刺雀被归类为北极特化物种，因为它们是繁殖范围最北的鸣禽之一。因此，它们为研究一个正在积极适应全球变化最快地区的物种提供了独特的机会。它们的繁殖地到达时间、领地行为的开始以及筑巢行为受到春季天气条件和暴风雪的显著影响（Custer and Pitelka, 1977; Fox et al., 1987; Boelman et al., 2017）。它们的繁殖窗口非常短暂，且与雄性激素水平的升高相关，这些激素促进了领地攻击性、空中展示和交配行为（Hunt et al., 1995; Hunt et al., 1997）。当雌性从产卵过渡到孵化期间，雄性体内的雄性激素水平会迅速下降（Hunt et al., 1995; Hunt et al., 1997）。然而，为了生存，它们的生理和行为必须迅速适应寒冷天气（Wingfield and Sapolsky, 2003）。在布鲁克斯山脉东北部地区，5月底和6月初由于暴风雪导致的繁殖中断频率正在上升，因为暴风雪发生的时间和频率都在增加（Tape et al., 2016; Krause et al., 2018）。
在本研究中，我们在繁殖季节的四个不同时间点采集了组织和血液样本，以量化基因表达、血浆皮质酮和睾酮浓度以及睾丸体积的变化。2013年，我们在一个极端寒冷且持续降雪的时期采集了雄性拉普兰长刺雀样本（Krause et al., 2016; Boelman et al., 2017）。长时间的极端寒冷导致它们向北迁徙的时间推迟了3-6天，繁殖地面临温度挑战和食物短缺，结果拉普兰长刺雀的体重、脂肪含量、血细胞比容和肌肉状况均有所下降（Krause et al., 2016）。此外，拉普兰长刺雀在基线和应激状态下的皮质酮水平升高，这可能有助于调动能量储备以应对寒冷天气的需求（Krause et al., 2016）。2016年，当天气和融雪情况更符合北极典型特征时，我们在它们到达繁殖地和孵化期间采集了样本，此时它们的整体身体状况良好（Krause et al., 2018）。最后，在2016年，我们还在孵化期间的一次多日暴风雪中采集了样本，这次暴风雪导致鸟类放弃了巢穴，形成了50-100只的大群，并导致90%的繁殖失败率（Krause et al., 2018）。暴风雪导致拉普兰长刺雀的应激诱导皮质酮水平升高，但基线水平未受影响（Krause et al., 2018）。
图1总结了本研究中核心的调控通路，这些通路控制着繁殖轴的激活和抑制。我们通过以下方法来表征不同繁殖阶段及应对寒冷天气事件时激素和基因表达的变化：1）单变量方法来确定基因特异性差异；2）线性判别分析（LDA）来确定是否存在不同的内分泌表型；3）网络分析来理解基因和激素之间的表型相关性和连接性。我们预测，在鸟类到达繁殖地期间，与HPG轴和HPA轴相关的基因表达会最高，因为HPG轴的激活先于产卵，而HPA轴在决定繁殖开始时间中起关键作用。在寒冷天气事件期间，我们预计HPA轴活性会升高，而HPG轴活性会受到抑制。由于这些复杂的表达模式，我们预计会观察到不同的表型和基因网络。最后，我们预测寒冷天气事件会升高皮质酮水平，并降低睾酮和睾丸质量。
研究物种
我们在美国阿拉斯加布鲁克斯山脉北坡的Toolik研究站附近研究了雄性拉普兰长刺雀（Calcarius lapponicus），该研究站位于北纬68°38′、西经149°36′。在我们的研究地点，太阳在5月22日出，直到7月21日才落山，因此所有样本都是在持续日照的环境中采集的。尽管有24小时的光照，拉普兰长刺雀仍表现出昼夜节律性的行为和褪黑素分泌模式。
睾丸体积
不同繁殖阶段的睾丸体积存在差异（F3,29 = 3.71, P = 0.02，图2A）。在典型条件下，从到达繁殖地到孵化期间睾丸体积没有变化。然而，长期极端寒冷导致到达繁殖地时的睾丸体积降低（t = 2.81, P = 0.04, Cohen's D = 1.42），而在孵化期间发生的暴风雪对睾丸体积没有影响（t = 1.50, P = 0.44, Cohen's D = 0.72）。
血浆睾酮
不同繁殖阶段的血浆睾酮浓度存在差异（F3,29 = 21.32, P
讨论
我们首次在任何野生自由生活动物中总结了急性和慢性极端天气对繁殖期间大脑和睾丸的影响。极端寒冷天气与春季迁徙同时发生，导致拉普兰长刺雀的生理、形态和行为发生显著变化（Krause et al., 2016; Boelman et al., 2017）。到达繁殖地时的极端寒冷条件导致睾丸体积减小和睾酮水平下降。我们还发现……
结论
在不断变化的世界中，迫切需要了解野生动物种群对极端天气事件的机制性反应。这是首篇发表的研究，描述了自由生活的野生动物如何通过睾丸形态、循环激素和基因表达的变化来应对极端天气事件。HPG轴的每个层次都经历了基因mRNA表达的变化，这些变化可以解释血浆睾酮和睾丸水平的观察差异。
作者贡献声明
Jesse S. Krause：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、验证、资源获取、项目管理、方法学设计、研究实施、资金申请、数据分析、数据管理、概念构建。Angus M.A. Reid：验证、研究实施、数据分析、数据管理。Jonathan H. Pérez：撰写——审稿与编辑、研究实施、数据分析、数据管理、概念构建。Jeffrey C. Cheah：研究实施、数据管理。Valerie R. Bishop：数据分析
作者贡献
JSK、JCW和SLM设计了研究并获得了资金支持。JSK、SLM、JHP和JCW进行了野外工作和组织采集。JSK、JCC、AMAR、VB、VTR、ARJ和JHP进行了分子实验室工作、引物设计和检测方法验证。JSK进行了数据分析并撰写了论文。所有作者对论文提供了重要反馈，同意对论文内容负责。
利益冲突声明
无。
致谢
本研究得到了美国国家科学基金会极地项目办公室ARC 0909133和综合有机体系统项目IOS 1558049的支持，以及英国生物技术和生物科学研究委员会对Simone L. Meddle的战略资助（BB/P013759/1, BBS/E/RL/230001C, BB/V001647/1）。我们还要感谢Helen E. Chmura和Caroline Newell在野外工作中的所有帮助。
